Transdução para Rotular células tumorais PDX: Introduzindo lentivírus expressando marcador fluorescente na célula tumoral in vitro

Lentivírus é um Retrovírus que contém material genético RNA. Este vírus fornece um método eficiente e estável de introduzir transgenes nas linhas celulares cancerosas. Comece adicionando neuraminidase a um tubo contendo Lentivírus que expressa proteína fluorescente verde, ou GFP. Mantenha o tubo a 37 graus Celsius por uma hora para aumentar a eficiência de ligação do vírus.

Em seguida, centrifugar um tubo contendo suspensão de células tumorais para formar uma pelota. Adicione mídia de mamografia contendo polibreno para resuspensar as células. Polybrene é um polímero cônico que aumenta a eficiência da infecção lentiviral. Agora plaque o número ideal de células tumorais por poço em uma placa de cultura de seis poços de tecido. Adicione a quantidade necessária de Lentivírus em cada poço da placa de cultura.

Gire a placa para misturar o conteúdo, e mantenha-se a 37 graus Celsius por 96 horas com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. O Lentivírus entra na célula e libera RNA. A transcrição reversa viral converte o RNA em DNA duplo encalhado que se integra ao genoma hospedeiro. Coloque a placa sob um microscópio fluorescente e monitore as células para uma transdução bem sucedida. As células transduzidas fluoresce devido à expressão GFP.

No protocolo de exemplo, realizaremos a transdução de células tumorais dissociadas por PDX com vetores lentivirais.

Para transduzir as células tumorais, centrifugar as células isoladas para resuspensão em dois mililitros de meio mammosfera. Após a contagem, centrífuga as células novamente e resuspensa a pelota em dois mililitros de mammosfera média, complementada com 20 microliters de polibreno. Em seguida, placa 2 vezes 10 para a quinta células tumorais viáveis por poço em uma ultra baixa adesão seis placas de cultura tecidual bem e partículas lentiviras para as células em uma multiplicidade de infecção de 10.

Gire a placa para misturar o vírus com as células e incubar as co-culturas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por até 96 horas, adicionando 500 microliters de meio de mamografia fresco após as primeiras 24 horas. Quando pelo menos 10% das células são GFP positivas, transfira as células transduzidas de pelo menos uma bem em um tubo cônico de 15 mililitros no gelo e lave o poço com um mililitro de meio mamosfera.

Acumule a lavagem com as células e centrifugar as células tumorais em 10 mililitros de HBSS mais HEPES. Finalmente, resuspenque as células em 50 microliters de extrato de matriz de porão no gelo e carregue as células incorporadas em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro para reimplantação.