Transduktion zur Kennzeichnung von PDX-Tumorzellen: Einführung des Lentivirus, der fluoreszierende Marker in die Tumorzelle in vitro ausdrückt

Lentivirus ist ein Retrovirus, das RNA-Genmaterial enthält. Dieses Virus bietet eine effiziente und stabile Methode zur Einführung von Transgenen in Krebszelllinien. Beginnen Sie mit der Zugabe von Neuraminidase zu einer Röhre, die das Lentivirus enthält, das grünes fluoreszierendes Protein (GFP) ausdrückt. Halten Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Bindungseffizienz des Virus zu erhöhen.

Als nächstes zentrifugieren Sie eine Röhre, die Tumorzellsuspension enthält, um ein Pellet zu bilden. Fügen Sie Mammosphärenmedien hinzu, die Polybren enthalten, um die Zellen wieder auszusetzen. Polybren ist ein kationisches Polymer, das die Effizienz der Lentiviral-Infektion erhöht. Jetzt platte die optimale Anzahl von Tumorzellen pro Brunnen in einer sechs Brunnen Gewebekulturplatte. Fügen Sie die erforderliche Menge an Lentivirus in jeden Brunnen der Kulturplatte.

Wirbeln Sie die Platte, um den Inhalt zu mischen, und halten Sie bei 37 Grad Celsius für 96 Stunden mit einer kontinuierlichen Versorgung mit Kohlendioxid. Das Lentivirus tritt in die Zelle ein und gibt RNA frei. Die virale Reverse-Transkriptase wandelt die RNA in doppelsträngige DNA um, die sich in das Wirtsgenom integriert. Legen Sie die Platte unter ein Fluoreszenzmikroskop und überwachen Sie Zellen für eine erfolgreiche Transduktion. Die transduzierten Zellen fluoreszieren durch GFP-Expression.

Im Beispielprotokoll führen wir die Transduktion von PDX-dissoziierten Tumorzellen mit Lentiviralvektoren durch.

Um die Tumorzellen zu transduzieren, zentrifugieren Sie die isolierten Zellen zur Resuspension in zwei Milliliter Mammosphärenmedium. Nach dem Zählen zentrieren Sie die Zellen wieder und setzen Sie das Pellet in zwei MilliliterN Mammosphärenmedium wieder auf, ergänzt durch 20 Mikroliter Polybren. Als nächstes Platte 2 mal 10 bis die fünfte lebensfähige Tumorzellen pro Brunnen in einer ultra niedrigen Haftung sechs Brunnen Gewebe Kulturplatte und LentiviralPartikel an die Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 10.

Wirbeln Sie die Platte, um das Virus mit den Zellen zu mischen und die Kokulturen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für bis zu 96 Stunden zu bebrüten, wobei nach den ersten 24 Stunden 500 Mikroliter frisches Mammosphärenmedium hinzugefügt werden. Wenn mindestens 10% der Zellen GFP-positiv sind, übertragen Sie die transduzierten Zellen von mindestens einem Bohrplatz in eine 15 Milliliter konische Röhre auf Eis und waschen Sie den Brunnen mit einem Milliliter Mammosphärenmedium.

Die Wäsche mit den Zellen bündeln und die Tumorzellen in 10 Milliliter HBSS plus HEPES zentrieren. Schließlich die Zellen in 50 Mikroliter Kellermatrix-Extrakt auf Eis wieder aussetzen und die eingebetteten Zellen zur Reimplantation in eine 0,5-Milliliter-Insulinspritze laden.