Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di studiare l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche utilizzando la microscopia elettronica crio-scansione di campioni di tessuto fogliare fratturati a freddo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare, come la caratterizzazione morfologica di cellule e organelli, la distribuzione dei complessi proteici integrali di membrana e la localizzazione dei biominerali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la frattura da congelamento viene eseguita sui tessuti fogliari, e quindi l'organizzazione supramolecolare della membrana tilacoide viene studiata all'interno dell'organello nativo e del contesto cellulare.

Sebbene questo metodo sia dimostrato qui per un campione biologico, può essere applicato anche a gel, polimeri e sistemi di somministrazione di farmaci. In generale, le persone che non conoscono queste procedure dovrebbero essere consapevoli del fatto che non tutti i campioni saranno ben congelati o adeguatamente fratturati. Per eseguire la criofissazione dei tessuti fogliari mediante congelamento ad alta pressione, iniziare utilizzando l'angolo di una lama di rasoio per graffiare il fondo della cavità di 0,1 millimetri di una piastrina di alluminio da 0,1 a 0,2 millimetri.

Preparare almeno una dozzina di piastrine per sei campioni. Quindi usa l'etanolo assoluto per lavare le piastrine e conservale in un piatto pulito. Dopo aver preparato la macchina per il congelamento ad alta pressione, riempire la scatola dei campioni con azoto liquido.

Con una lama di rasoio, taglia un pezzetto di foglia dalla pianta e usa una pinzetta per posizionare il tessuto all'interno di una provetta da microcentrifuga riempita a metà con un esadecano. Per infiltrarsi negli spazi intercellulari del tessuto fogliare, inserire la punta del dispositivo di infiltrazione, preparato come descritto nel protocollo di testo, nel foro del coperchio della provetta per microcentrifuga, e tirare lo stantuffo per creare il vuoto. Dopo circa 30 secondi, rilasciare lo stantuffo.

Quindi, usando una pinzetta, rimuovi il pezzo di foglia dal tubo. Usa la lama del rasoio per tagliare un pezzo abbastanza piccolo da entrare in una piastrina. E, se necessario, taglia la foglia a uno spessore inferiore a 0,2 millimetri.

Per prevenire il collasso dei tessuti, le foglie vengono infiltrate con liquido prima del congelamento ad alta pressione. Lo spessore del campione viene mantenuto al di sotto di 200 micron per massimizzare la possibilità di ottenere un campione vetrificato. Posizionare una piastrina pulita con il lato graffiato rivolto verso l'alto nel supporto della macchina per il congelamento.

E poi metti il pezzo di foglia tagliato nella piastrina. Usa un esadecano per riempire lo spazio rimanente della piastrina prima di usare un'altra piastrina con i graffi rivolti verso la foglia per chiudere il panino. Chiudere e serrare il supporto.

Congelare il campione premendo il pulsante a getto. Quindi, trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Utilizzare le pinzette precool per rimuovere il panino dal supporto, facendo attenzione a non fratturarlo.

Ci sono due passaggi critici nella procedura: la frattura da congelamento, che è un processo casuale e il suo successo può essere valutato solo nel crio-SEM e nel rivestimento a doppio strato, necessario per ottenere immagini ad alto ingrandimento con danni minimi al raggio. Durante la preparazione e la programmazione della macchina per congelamento e frattura secondo le istruzioni del produttore, posizionare la pistola al carbonio platino o Pt/C a 45 gradi e la pistola al carbonio a 90 gradi. Raffreddare lo stadio del sistema di congelamento-frattura a meno 140 o meno 160 gradi Celsius.

Quindi collegare la navetta di trasferimento criogenico sottovuoto alla macchina e utilizzare azoto liquido per riempire la camera della navetta. Inserire un portacampioni di liofilizzazione nella stazione di carico e inondare con azoto liquido la camera della stazione di caricamento. Quindi, utilizzando una pinzetta di alta precisione, caricare un panino congelato sul supporto e serrarlo in posizione.

Quindi capovolgere il supporto per verificare che il panino sia fissato in posizione e ripetere per un secondo panino. Staccare la navetta raffreddata dalla macchina per il congelamento e la frattura e collegarla alla stazione di carico. Quindi aprire la valvola della navetta, introdurre il braccio retrattile nel supporto, bloccarlo in posizione e reintrodurre il braccio con il supporto nella navetta.

Dopo aver riattaccato la navetta alla macchina per la criofrattura, introdurre il supporto nella camera, utilizzando il braccio retrattile. Ora allinea il coltello per microtomo per fratture da congelamento all'altezza in modo tale da far cadere le piastrine superiori dei panini. Con il coltello da microtomo, rompi velocemente i panini.

E poi sollevare immediatamente il coltello per evitare la contaminazione dei campioni da parte di detriti aggrappati al coltello. Posizionare l'otturatore raffreddato sopra il piano appena esposto per proteggere i campioni da possibili contaminazioni da parte delle molecole d'acqua nella camera. Quindi, per rivestire i campioni con platino, premere Setup per visualizzare il Layer 1 sullo schermo.

Quindi accendere la pistola Pt/C premendo il pulsante GUN 1 seguito dal pulsante ON. Esaminare il tasso di evaporazione e, una volta raggiunto da 0,02 a 0,04 nanometri al secondo, premere il pulsante Misura per monitorare lo spessore dello strato depositato esponendo contemporaneamente i campioni. Per rivestire con il carbonio, selezionare GUN 2 seguito dal pulsante ON.

Una volta che la velocità di evaporazione è di circa 0,1 nanometri al secondo, premere il pulsante Misura e contemporaneamente spostare l'otturatore per esporre i campioni. Quando il rivestimento è completo, riscaldare il tavolino a meno 120 gradi Celsius. Per preparare il microscopio elettronico a scansione per il lavoro criogenico, dal menu principale selezionare Stage, Stage Initialize e confermare.

Nella scheda Vuoto, fare clic sul pulsante Sfiato per sfiatare la camera del microscopio. Quindi selezionare Strumenti, Pannello Vai a e aprire il pannello Elenco punti stage. Selezionare la posizione CRYO EXCHANGE per spostare il tavolino alle coordinate corrette per l'accettazione del portacampioni.

Indossando un paio di guanti puliti, aprire la camera del campione e inserire il criostadio sul tavolino principale del microscopio. Chiudere la camera e, nella scheda Vuoto, fare clic sul pulsante Pompa. Quindi, raffreddare il microscopio riempiendolo con azoto liquido.

Una volta che la temperatura del tavolino scende sotto i meno 120 gradi Celsius, attivare la funzione di calore sull'unità di trasferimento criogenico per riscaldare il tavolino a meno 120 gradi Celsius. Ora collega la navetta di trasferimento criogenico al microscopio e trasferisci il portacampione utilizzando il braccio retrattile nel tavolino criogenico del microscopio. Utilizzando il joystick, avvicinare con cautela il portacampione alla lente dell'obiettivo.

Nella scheda Aperture, selezionare l'apertura di 10 micron. Quindi, nella scheda Pistola fare doppio clic sul campo Target EHT, immettere 10 kilovolt per il target EHT e fare clic su OK. Quindi, per attivare l'accelerazione della tensione, fare clic sulla scheda EHT in basso e selezionare EHT On.In scheda Rilevatori, selezionare InLens dall'elenco a discesa. Quindi fai clic sulla scheda Scansione e scegli una velocità di scansione uguale a uno, che è una scansione veloce per ridurre al minimo i danni al raggio e una risoluzione del negozio di 1024 per 768 pixel.

Nell'elenco a discesa Riduzione rumore, selezionare Media linea e regolare il valore di n su 20-30 righe per la ricerca. Quindi, facendo clic sui tasti Ctrl e Tab sulla tastiera, utilizzare la funzione del punto centrale per spostare il campione nelle aree di interesse e contemporaneamente ingrandire per identificare le regioni con cellule fratturate. Dopo aver identificato le regioni con cellule fratturate, scansionare il campione durante l'ingrandimento per trovare un cloroplasto fratturato.

Quindi modificare il valore n medio della linea su un valore maggiore di 100, per la riduzione del rumore. Nella scheda Scansione, premere Blocca per interrompere la scansione. Premendo Control Shift Tab sulla tastiera, la funzione centrale viene utilizzata per ingrandire interessanti facce di frattura dei cloroplasti; e le immagini ad alto ingrandimento vengono acquisite utilizzando gli stessi parametri di prima.

Infine, premi il pulsante Salva TIFF per salvare l'immagine. Eseguire l'analisi delle immagini secondo il protocollo di testo. Questa figura mostra un'immagine crio-SEM di una piastrina contenente un pezzo di foglia di Craterostigma Pumilum congelato congelato ad alta pressione con un'ampia regione di cellule fratturate.

In questo esempio, manca il pezzo di foglia; ma rimaneva un po' di tessuto fogliare, attaccato alle scanalature del coltello sulla piastrina. Dopo che è stata trovata una frattura riuscita, vengono acquisite immagini a basso ingrandimento delle cellule per identificare le regioni di interesse, come i cloroplasti fratturati. Vengono acquisite immagini di cloroplasti a frattura singola per identificare le facce delle fratture della membrana tilacoidale.

In questo esempio è mostrata un'immagine ad alto ingrandimento delle membrane tilacoidi nelle foglie di C.Pumilum. Si possono distinguere le quattro diverse facce di frattura. Le facce di frattura esoplasmatica delle membrane impilate e non impilate, EF ed EFu rispettivamente, e le facce protoplasmatiche delle membrane impilate e non impilate, PF e PFu rispettivamente.

Il fotosistema II, o PS2, si trova sia nelle regioni della membrana grana impilata EF che nelle regioni della membrana stromammalare EFu. Quando idratata, la densità di PS2 è circa tre volte superiore nelle EF rispetto all'EFu, il che differenzia le due facce. Durante la disidratazione di C.Pumilum, la densità di PS2 nelle FE diminuisce gradualmente, raggiungendo circa la metà della sua densità in condizioni di idratazione.

In particolare, dopo un'ulteriore disidratazione al 5-10% di contenuto relativo di acqua, i complessi PS2 si organizzano in file e array. Lo sviluppo della tecnica di replica della frattura da congelamento ha aperto la strada allo studio delle dimensioni dei complessi proteici di membrana e della loro disposizione all'interno delle membrane biologiche. La combinazione di frattura da congelamento con congelamento ad alta pressione nel crio-SEM consente di studiare vari tipi di campioni su diverse scale dimensionali, dai livelli tissutali e cellulari fino al livello macromolecolare in uno stato quasi nativo.

Oltre alla tecnica qui mostrata, metodi come la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia, EDS, possono essere applicati anche nel crio-SEM; ad esempio, per i biominerali alcalinizzanti.