Quantificazione fotometrica della concentrazione di proteine
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Overview
La misurazione della concentrazione è un passo fondamentale di molti saggi biochimici. La determinazione fotometrica delle proteine sfrutta il fatto che più un campione contiene sostanze che assorbono la luce, meno la luce trasmetterà attraverso di esso. Poiché la relazione tra concentrazione e assorbimento è lineare, questo fenomeno può essere utilizzato per misurare la concentrazione in campioni in cui è sconosciuta.
Questo video descrive le basi della determinazione fotometrica delle proteine e introduce il saggio Bradford e il metodo Lowry. La procedura nel video coprirà un tipico test di Bradford. Le applicazioni coperte includono la misurazione diretta di volumi molto piccoli di acidi nucleici per caratterizzare la concentrazione e la purezza, la determinazione dell’efficienza di accoppiamento di un materiale biomimetico e un’altra variazione della determinazione fotometrica delle proteine utilizzando il colorante Remazol.
Determinare la concentrazione di una proteina nei campioni è un passo fondamentale in molti saggi biochimici. La determinazione fotometrica può essere eseguita con campioni di piccole dimensioni. Più un campione contiene sostanze che assorbono la luce, meno la luce trasmetterà attraverso di esso. Ciò fornisce una misurazione quantitativa delle sostanze assorbenti. Questi concetti sono così fondamentali per la scienza che gli articoli che hanno introdotto due delle tecniche sono nei tre articoli più citati di tutti i tempi. Questo video mostrerà i concetti alla base di alcune delle più comuni tecniche di determinazione fotometrica delle proteine, come vengono eseguite e come vengono analizzati i dati raccolti.
La determinazione fotometrica delle proteine si basa sulla relazione tra concentrazione e assorbenza della luce. Questo è noto come la legge di Beer-Lambert, che afferma che la concentrazione di una specie che assorbe la luce è proporzionale alla sua assorbanza.
Questo principio è alla base di tutti i metodi di determinazione fotometrica delle proteine.
Per l’analisi dell’assorbimento diretto, vengono misurati i valori di assorbanza dei campioni proteici inalterati. A causa delle loro catene laterali aromatiche, i residui di triptofano e tirosina danno le più alte letture di assorbanza a una lunghezza d’onda di 280 nm.
Tuttavia, questi amminoacidi, che sono due dei meno frequenti presenti nelle proteine, sono presenti in quantità diverse in ogni proteina, quindi ogni determinazione è unica. Per superare questa limitazione, sono stati sviluppati saggi più complessi che non dipendono da questi amminoacidi.
Un esempio è il Bradford Assay, in cui il colorante colorato viene aggiunto al campione. Il colorante, noto come Coomassie Blue, risponde proporzionalmente: più proteine presenti, più eventi leganti con il colorante.
Quindi, la concentrazione proteica viene determinata misurando l’assorbanza del colorante Coomassie Blue legato, che assorbe la luce a 594 nm. Tuttavia, il saggio di Bradford è lineare su un breve intervallo di concentrazioni, quindi le diluizioni sono spesso necessarie prima dell’analisi.
Il metodo Lowry combina il reagente Biuret, una soluzione alcalina di ioni rame che reagiscono con i legami peptidici, e il reagente Folin-Ciocâlteu, che ossida i residui proteici aromatici. Il cambiamento di colore risultante del campione è proporzionale alla concentrazione proteica.
L’assorbanza del reagente Folin ridotto può essere determinata a 750 nm. Come l’assorbimento diretto, ogni proteina ha una risposta unica e deve essere calibrata per la proteina di interesse. Ora che abbiamo esaminato i principi di base alla base di alcuni dei test più comuni, diamo un’occhiata a come vengono eseguiti l’assorbimento diretto e il test di Bradford.
Per iniziare un’analisi di assorbimento diretto, lo spettrofotometro viene calibrato con un bianco per determinare l’assorbanza zero. Le soluzioni standard sono preparate per l’uso nella creazione della curva di calibrazione. Quindi, un’aliquota del primo standard viene aggiunta a una cuvetta e inserita nello spettrofotometro.
Viene quindi registrato il valore di assorbanza a 280 nm. Questo processo viene ripetuto per ogni standard, utilizzando una cuvetta pulita per ogni corsa. Una volta completata, viene creata una curva di calibrazione tracciando l’assorbanza rispetto alla concentrazione. La pendenza di questa linea è il coefficiente di attenuazione molare, che mette in relazione l’assorbanza con la concentrazione.
Successivamente, il campione sconosciuto viene aggiunto a una cuvetta e viene registrato il valore di assorbanza. Poiché l’analisi dei dati per i diversi metodi di determinazione fotometrica è simile, ne parleremo dopo aver esaminato il test di Bradford.
Qui, il test delle proteine di Bradford viene eseguito con uno standard BSA su una piastra a 96 pozzetti. Per iniziare, vengono preparate soluzioni stock BSA.
Le soluzioni sconosciute vengono diluite con acqua deionizzata per garantire che le concentrazioni rientrino nell’intervallo del test. A seconda del kit, il colorante Coomassie può anche richiedere la diluizione. Quindi, la curva di calibrazione viene impostata aggiungendo gli standard BSA alla piastra a 96 pozzi.
L’acqua deionizzata viene aggiunta per raggiungere la concentrazione necessaria per generare una curva standard. Il campione sconosciuto deve essere aggiunto alla piastra in triplice copia per garantire una misurazione accurata. Il colorante Coomassie viene aggiunto successivamente a ciascun pozzo, mescolando con la pipetta.
L’acqua deionizzata viene aggiunta a un pozzo vuoto come un bianco, per misurare l’assorbanza. Dopo aver atteso 5 minuti affinché il colorante si leghi, l’assorbanza viene misurata in un lettore di piastre a 590 nm.
Ora che abbiamo eseguito alcuni test, diamo un’occhiata a come analizzare i dati. Ogni metodo fotometrico di determinazione delle proteine si basa sulla legge di Beer-Lambert.
L’assorbanza misurata degli standard viene utilizzata per creare una curva di calibrazione, che viene quindi utilizzata per determinare la concentrazione di campioni sconosciuti. Questa curva può essere tracciata manualmente, anche se i più recenti strumenti spettrofotometrici creeranno la curva di calibrazione una volta che tutti gli standard sono stati misurati. Questi sistemi calcoleranno anche la concentrazione di proteine man mano che vengono analizzati campioni sconosciuti.
Ora che abbiamo esaminato come analizzare i dati fotometrici di determinazione delle proteine, diamo un’occhiata ad alcuni dei modi in cui queste procedure vengono utilizzate.
I principi della determinazione fotometrica delle proteine possono anche essere utilizzati per misurare direttamente la concentrazione di acido nucleico. Lo spettrofotometro nanodrop accetta campioni di volume molto piccolo su un piedistallo otticamente attivo. L’assorbanza viene quindi misurata e il sistema determina automaticamente la concentrazione di acido nucleico. Poiché le proteine e altre fonti possono interferire con le misurazioni, la purezza del campione viene determinata analizzando i rapporti di assorbanza da 260 a 280 nm e da 260 a 230 nm. Gli acidi nucleici puri producono tipicamente rapporti di circa 1,8 e circa 2,0 per DNA e RNA, rispettivamente.
La determinazione fotometrica delle proteine può essere utilizzata anche nella produzione di materiali biomimetici, che si ispirano alla natura per suscitare specifiche risposte cellulari. Le avesi ricombinanti sono legate a perline di polistirene per simulare l’attaccamento batterico alle cellule ospiti. Il saggio di Bradford viene utilizzato per determinare l’efficienza di accoppiamento dell’adesione ricombinante alle perle nella produzione del materiale biomimetico.
Saggi proteici fotometrici alternativi possono essere utilizzati nella rilevazione e caratterizzazione di antimicrobici proteici. Il colorante R blu brillante Remazol è legato covalentemente ai batteri uccisi dal calore. La proteina antimicrobica viene incubata nella soluzione tinta. Quindi, il campione viene centrifugato e l’assorbanza del surnatante a 595 nm viene misurata utilizzando uno spettrofotometro a micropiasche. L’aumentata assorbanza, dal colorante solubile rilasciato nel surnatante dai batteri etichettati, è una misura quantitativa dell’attività enzimatica.
Hai appena visto il video di JoVE sulla determinazione fotometrica delle proteine. Questo video descriveva i principi alla base della determinazione fotometrica, superò le procedure generali per alcuni saggi comuni e coprì alcuni nuovi progressi nelle tecniche. Grazie per l’attenzione!
Procedure
Disclosures
Transcript
Determining the concentration of a protein in samples is a fundamental step in many biochemical assays. Photometric determination can be done with small sample sizes. The more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. This provides a quantitative measurement of the absorbing substances. These concepts are so fundamental to science that the articles that introduced two of the techniques are in the three most cited papers of all time. This video will show the concepts behind some of the most common photometric protein determination techniques, how they are performed, and how the gathered data is analyzed.
Photometric protein determination is based on the relationship between concentration and light absorbency. This is known as the Beer-Lambert Law, which states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance.
This principle underlies all photometric protein determination methods.
For direct absorption analysis, the absorbance values of unaltered protein samples are measured. Because of their aromatic side chains, tryptophan and tyrosine residues give the highest absorbance readings at a wavelength of 280 nm.
However, these amino acids-which are two of the least frequently found in proteins-are present in different amounts in every protein, so each determination is unique. To overcome this limitation, more complex assays-that are not dependent on these amino acids-were developed.
One example is the Bradford Assay, where colored dye is added to the sample. The dye, known as Coomassie Blue, responds proportionally-the more protein present, the more binding events with the dye.
Then, protein concentration is determined by measuring the absorbance of the bound Coomassie Blue dye, which absorbs light at 594 nm. However, the Bradford assay is linear over a short range of concentrations, so dilutions are often required before analysis.
The Lowry Method combines the Biuret reagent, an alkaline solution of copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Ciocâlteu reagent, which oxidizes aromatic protein residues. The resulting color change of the sample is proportional to the protein concentration.
The absorbance of the reduced Folin reagent can be determined at 750 nm. Like direct absorption, each protein has a unique response, and must be calibrated for the protein of interest. Now that we’ve reviewed the basic principles behind some of the most common assays, let’s look at how direct absorption and the Bradford assay are performed.
To begin a direct absorption analysis, the spectrophotometer is calibrated with a blank to determine zero absorbance. Standard solutions are prepared for use in creating the calibration curve. Then, an aliquot of the first standard is added to a cuvette, and placed into the spectrophotometer.
The absorbance value at 280 nm is then recorded. This process is repeated for each standard, using a clean cuvette for each run. Once complete, a calibration curve is created by plotting the absorbance versus concentration. The slope of this line is the molar attenuation coefficient, which relates absorbance to concentration.
Next, the unknown sample is added to a cuvette, and the absorbance value is recorded. As the data analysis for the different photometric determination methods is similar, we will cover that after we look at the Bradford assay.
Here, the Bradford protein assay is performed with a BSA standard on a 96-well plate. To begin, BSA stock solutions are prepared.
The unknown solutions are diluted with deionized water to ensure that the concentrations are within the assay’s range. Depending on the kit, the Coomassie dye may also require dilution. Then, the calibration curve is set up by adding the BSA standards to the 96-well plate.
Deionized water is added to reach the needed concentration to generate a standard curve. The unknown sample should be added to the plate in triplicates to ensure an accurate measurement is taken. Coomassie dye is next added to each well, mixing with the pipette.
Deionized water is added to an empty well as a blank, to measure the absorbance. After waiting 5 min for the dye to bind, the absorbance is measured in a plate-reader at 590 nm.
Now that we’ve performed a few assays, let’s look at how to analyze the data. Each photometric protein determination method is based on the Beer-Lambert Law.
The measured absorbance of the standards is used to create a calibration curve, which is then used to determine the concentration of unknown samples. This curve can be manually plotted, though newer spectrophotometric tools will create the calibration curve once all standards have been measured. These systems will also calculate protein concentration as unknown samples are analyzed.
Now that we’ve reviewed how to analyze photometric protein determination data, let’s look at some of the ways these procedures are utilized.
The principles of photometric protein determination can also be used to directly measure nucleic acid concentration. The nanodrop spectrophotometer accepts samples of very small volume onto an optically active pedestal. The absorbance is then measured, and the system automatically determines the nucleic acid concentration. Because proteins and other sources can interfere with measurements, sample purity is determined by analyzing the 260 to 280 nm and 260 to 230 nm absorbance ratios. Pure nucleic acids typically yield ratios of approximately 1.8 and approximately 2.0 for DNA and RNA, respectively.
Photometric protein determination can also be used in the production of biomimetic materials, which are inspired from nature to elicit specific cellular responses. Recombinant adhesins are bound to polystyrene beads to simulate bacterial attachment to host cells. The Bradford assay is used to determine the coupling efficiency of the recombinant adhesion to the beads in the production of the biomimetic material.
Alternative photometric protein assays can be used in the detection and characterization of protein antimicrobials. Remazol brilliant blue R dye is covalently bonded to heat-killed bacteria. The protein antimicrobial is incubated in the dyed solution. Then, the sample is centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 595 nm is measured using a microplate spectrophotometer. Increased absorbance, by the soluble dye released into the supernatant from the labeled bacteria, is a quantitative measurement of enzymatic activity.
You’ve just watched JoVE’s video on photometric protein determination. This video described the underlying principles of photometric determination, went over general procedures for some common assays, and covered some new advances in techniques. Thanks for watching!
