Determinação Fotométrica de Proteína
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Overview
Medir a concentração é um passo fundamental de muitos ensaios bioquímicos. A determinação da proteína fotométrica aproveita o fato de que quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Como a relação entre concentração e absorção é linear, esse fenômeno pode ser usado para medir a concentração em amostras onde é desconhecido.
Este vídeo descreve o básico da determinação da proteína fotométrica e introduz o Bradford Assay e o Método Lowry. O procedimento no vídeo cobrirá um típico ensaio de Bradford. As aplicações abrangidas incluem a medição direta de volumes muito pequenos de ácidos nucleicos para caracterizar concentração e pureza, determinação da eficiência do acoplamento de um material biomimético, e outra variação da determinação da proteína fotométrica usando corante Remazol.
Determinar a concentração de uma proteína em amostras é um passo fundamental em muitos ensaios bioquímicos. A determinação fotométrica pode ser feita com pequenos tamanhos de amostra. Quanto mais uma amostra contém substâncias absorventes de luz, menos a luz transmitirá através dela. Isso fornece uma medição quantitativa das substâncias absorventes. Esses conceitos são tão fundamentais para a ciência que os artigos que introduziram duas das técnicas estão nos três trabalhos mais citados de todos os tempos. Este vídeo mostrará os conceitos por trás de algumas das técnicas mais comuns de determinação de proteínas fotométricas, como são realizadas e como os dados coletados são analisados.
A determinação da proteína fotométrica baseia-se na relação entre concentração e absorção de luz. Esta é conhecida como a Lei Beer-Lambert, que afirma que a concentração de uma espécie absorvente de luz é proporcional à sua absorção.
Este princípio está por trás de todos os métodos de determinação de proteína fotométrica.
Para análise direta de absorção, os valores de absorção de amostras de proteínas não residenciais são medidos. Por causa de suas cadeias laterais aromáticas, resíduos de triptofano e tyrosina dão as leituras de maior absorvência a um comprimento de onda de 280 nm.
No entanto, esses aminoácidos – que são dois dos menos frequentemente encontrados em proteínas – estão presentes em diferentes quantidades em cada proteína, de modo que cada determinação é única. Para superar essa limitação, foram desenvolvidos ensaios mais complexos – que não dependem desses aminoácidos.
Um exemplo é o Ensaio de Bradford, onde o corante colorido é adicionado à amostra. O corante, conhecido como Coomassie Blue, responde proporcionalmente quanto mais proteína presente, mais eventos vinculativos com o corante.
Em seguida, a concentração proteica é determinada medindo a absorvância do corante Coomassie Blue, que absorve a luz a 594 nm. No entanto, o ensaio de Bradford é linear sobre uma pequena gama de concentrações, por isso as diluições são frequentemente necessárias antes da análise.
O Método Lowry combina o reagente Biuret, uma solução alcalina de íons de cobre que reagem com ligações de peptídeos, e o reagente Folin-Ciocâlteu, que oxida resíduos de proteína aromática. A mudança de cor resultante da amostra é proporcional à concentração proteica.
A absorção do reagente Folin reduzido pode ser determinada em 750 nm. Como a absorção direta, cada proteína tem uma resposta única, e deve ser calibrada para a proteína de interesse. Agora que revisamos os princípios básicos por trás de alguns dos ensaios mais comuns, vamos ver como a absorção direta e o ensaio de Bradford são realizados.
Para iniciar uma análise direta de absorção, o espectotômetro é calibrado com um branco para determinar a absorção zero. As soluções padrão são preparadas para uso na criação da curva de calibração. Em seguida, uma alíquota do primeiro padrão é adicionada a um cuvette e colocada no espectrômetro.
O valor de absorção em 280 nm é então registrado. Este processo é repetido para cada padrão, usando uma cuvette limpa para cada execução. Uma vez concluída, uma curva de calibração é criada plotando a absorvência versus concentração. A inclinação desta linha é o coeficiente molar atenuante, que relaciona a absorção à concentração.
Em seguida, a amostra desconhecida é adicionada a um cuvette, e o valor de absorção é registrado. Como a análise de dados para os diferentes métodos de determinação fotométrica é semelhante, vamos cobrir isso depois de olharmos para o ensaio de Bradford.
Aqui, o ensaio de proteína de Bradford é realizado com um padrão BSA em uma placa de 96 poços. Para começar, as soluções de estoque da BSA estão preparadas.
As soluções desconhecidas são diluídas com água deionizada para garantir que as concentrações estejam dentro do alcance do ensaio. Dependendo do kit, o corante Coomassie também pode exigir diluição. Em seguida, a curva de calibração é configurada adicionando os padrões BSA à placa de 96 poços.
A água desionizada é adicionada para atingir a concentração necessária para gerar uma curva padrão. A amostra desconhecida deve ser adicionada à placa em triplicados para garantir que uma medição precisa seja tomada. Corante coomassie é adicionado a cada poço, misturando-se com a pipeta.
A água desionizada é adicionada a um vazio, bem como um branco, para medir a absorvência. Depois de esperar 5 min para o corante se ligar, a absorvância é medida em um leitor de placas a 590 nm.
Agora que fizemos alguns ensaios, vamos ver como analisar os dados. Cada método de determinação de proteína fotométrica é baseado na Lei Beer-Lambert.
A absorvância medida dos padrões é usada para criar uma curva de calibração, que é então usada para determinar a concentração de amostras desconhecidas. Esta curva pode ser plotada manualmente, embora ferramentas espectrofotométricas mais novas criem a curva de calibração uma vez que todos os padrões tenham sido medidos. Esses sistemas também calcularão a concentração de proteínas à medida que amostras desconhecidas forem analisadas.
Agora que revisamos como analisar dados de determinação de proteína fotométrica, vamos ver algumas das maneiras como esses procedimentos são utilizados.
Os princípios da determinação da proteína fotométrica também podem ser usados para medir diretamente a concentração de ácido nucleico. O espectrofotômetro de nanodrop aceita amostras de volume muito pequeno em um pedestal opticamente ativo. A absorção é então medida, e o sistema determina automaticamente a concentração de ácido nucleico. Como as proteínas e outras fontes podem interferir nas medições, a pureza amostral é determinada analisando as razões de absorção de 260 a 280 nm e 260 a 230 nm. Ácidos nucleicos puros normalmente produzem proporções de aproximadamente 1,8 e aproximadamente 2,0 para DNA e RNA, respectivamente.
A determinação da proteína fotométrica também pode ser usada na produção de materiais biomiméticos, que são inspirados da natureza para obter respostas celulares específicas. Os adesivos recombinantes são ligados a contas de poliestireno para simular o apego bacteriano às células hospedeiras. O ensaio de Bradford é usado para determinar a eficiência de acoplamento da adesão recombinante às contas na produção do material biomimético.
Os ensaios alternativos de proteína fotométrica podem ser usados na detecção e caracterização de antimicrobianos proteicos. Remazol brilhante corante R azul é covalentemente ligado a bactérias mortas pelo calor. O antimicrobiano proteico é incubado na solução tingida. Em seguida, a amostra é centrifugada, e a absorção do supernante a 595 nm é medida usando um espectrofotômetro microplatográfico. O aumento da absorvência, pelo corante solúvel liberado no sobrenasal das bactérias rotuladas, é uma medida quantitativa da atividade enzimática.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre determinação de proteína fotométrica. Este vídeo descreveu os princípios subjacentes da determinação fotométrica, passou por cima de procedimentos gerais para alguns ensaios comuns, e cobriu alguns novos avanços nas técnicas. Obrigado por assistir!
Procedure
Disclosures
Transcript
Determining the concentration of a protein in samples is a fundamental step in many biochemical assays. Photometric determination can be done with small sample sizes. The more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. This provides a quantitative measurement of the absorbing substances. These concepts are so fundamental to science that the articles that introduced two of the techniques are in the three most cited papers of all time. This video will show the concepts behind some of the most common photometric protein determination techniques, how they are performed, and how the gathered data is analyzed.
Photometric protein determination is based on the relationship between concentration and light absorbency. This is known as the Beer-Lambert Law, which states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance.
This principle underlies all photometric protein determination methods.
For direct absorption analysis, the absorbance values of unaltered protein samples are measured. Because of their aromatic side chains, tryptophan and tyrosine residues give the highest absorbance readings at a wavelength of 280 nm.
However, these amino acids-which are two of the least frequently found in proteins-are present in different amounts in every protein, so each determination is unique. To overcome this limitation, more complex assays-that are not dependent on these amino acids-were developed.
One example is the Bradford Assay, where colored dye is added to the sample. The dye, known as Coomassie Blue, responds proportionally-the more protein present, the more binding events with the dye.
Then, protein concentration is determined by measuring the absorbance of the bound Coomassie Blue dye, which absorbs light at 594 nm. However, the Bradford assay is linear over a short range of concentrations, so dilutions are often required before analysis.
The Lowry Method combines the Biuret reagent, an alkaline solution of copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Ciocâlteu reagent, which oxidizes aromatic protein residues. The resulting color change of the sample is proportional to the protein concentration.
The absorbance of the reduced Folin reagent can be determined at 750 nm. Like direct absorption, each protein has a unique response, and must be calibrated for the protein of interest. Now that we’ve reviewed the basic principles behind some of the most common assays, let’s look at how direct absorption and the Bradford assay are performed.
To begin a direct absorption analysis, the spectrophotometer is calibrated with a blank to determine zero absorbance. Standard solutions are prepared for use in creating the calibration curve. Then, an aliquot of the first standard is added to a cuvette, and placed into the spectrophotometer.
The absorbance value at 280 nm is then recorded. This process is repeated for each standard, using a clean cuvette for each run. Once complete, a calibration curve is created by plotting the absorbance versus concentration. The slope of this line is the molar attenuation coefficient, which relates absorbance to concentration.
Next, the unknown sample is added to a cuvette, and the absorbance value is recorded. As the data analysis for the different photometric determination methods is similar, we will cover that after we look at the Bradford assay.
Here, the Bradford protein assay is performed with a BSA standard on a 96-well plate. To begin, BSA stock solutions are prepared.
The unknown solutions are diluted with deionized water to ensure that the concentrations are within the assay’s range. Depending on the kit, the Coomassie dye may also require dilution. Then, the calibration curve is set up by adding the BSA standards to the 96-well plate.
Deionized water is added to reach the needed concentration to generate a standard curve. The unknown sample should be added to the plate in triplicates to ensure an accurate measurement is taken. Coomassie dye is next added to each well, mixing with the pipette.
Deionized water is added to an empty well as a blank, to measure the absorbance. After waiting 5 min for the dye to bind, the absorbance is measured in a plate-reader at 590 nm.
Now that we’ve performed a few assays, let’s look at how to analyze the data. Each photometric protein determination method is based on the Beer-Lambert Law.
The measured absorbance of the standards is used to create a calibration curve, which is then used to determine the concentration of unknown samples. This curve can be manually plotted, though newer spectrophotometric tools will create the calibration curve once all standards have been measured. These systems will also calculate protein concentration as unknown samples are analyzed.
Now that we’ve reviewed how to analyze photometric protein determination data, let’s look at some of the ways these procedures are utilized.
The principles of photometric protein determination can also be used to directly measure nucleic acid concentration. The nanodrop spectrophotometer accepts samples of very small volume onto an optically active pedestal. The absorbance is then measured, and the system automatically determines the nucleic acid concentration. Because proteins and other sources can interfere with measurements, sample purity is determined by analyzing the 260 to 280 nm and 260 to 230 nm absorbance ratios. Pure nucleic acids typically yield ratios of approximately 1.8 and approximately 2.0 for DNA and RNA, respectively.
Photometric protein determination can also be used in the production of biomimetic materials, which are inspired from nature to elicit specific cellular responses. Recombinant adhesins are bound to polystyrene beads to simulate bacterial attachment to host cells. The Bradford assay is used to determine the coupling efficiency of the recombinant adhesion to the beads in the production of the biomimetic material.
Alternative photometric protein assays can be used in the detection and characterization of protein antimicrobials. Remazol brilliant blue R dye is covalently bonded to heat-killed bacteria. The protein antimicrobial is incubated in the dyed solution. Then, the sample is centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 595 nm is measured using a microplate spectrophotometer. Increased absorbance, by the soluble dye released into the supernatant from the labeled bacteria, is a quantitative measurement of enzymatic activity.
You’ve just watched JoVE’s video on photometric protein determination. This video described the underlying principles of photometric determination, went over general procedures for some common assays, and covered some new advances in techniques. Thanks for watching!
