Determinación fotométrica de proteínas
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Overview
Medición de la concentración es un paso fundamental de muchos ensayos bioquímicos. Determinación fotométrica de la proteína aprovecha el hecho de cuanto más una muestra contiene sustancias absorben la luz, menos la luz se transmite a través de él. Puesto que la relación entre concentración y absorción es linear, este fenómeno puede utilizarse para medir la concentración en las muestras donde no se sabe.
Este video describe los fundamentos de la determinación fotométrica de proteínas y presenta el ensayo de Bradford y el método de Lowry. En el vídeo se incluyen un típico ensayo de Bradford. Usos cubiertos incluyen la medición directa de volúmenes muy pequeños de ácidos nucleicos para caracterizar la concentración y pureza, determinación de la eficiencia de un material biomimético y otra variación de determinación fotométrica de la proteína usando colorante Remazol de acoplamiento.
Determinar la concentración de una proteína en las muestras es un paso fundamental en muchos ensayos bioquímicos. Determinación fotométrica puede hacerse con muestras pequeñas. Más una muestra contiene sustancias absorben la luz, menos la luz se transmite a través de él. Esto proporciona una medida cuantitativa de las sustancias absorbentes. Estos conceptos son tan fundamentales a la ciencia que son los artículos que introducen dos de las técnicas en los tres trabajos más citados de todos los tiempos. Este video le mostrará los conceptos detrás de algunas de la proteína fotométrica más comun técnicas de determinación, cómo se realizan y cómo se analizan los datos obtenidos.
Determinación fotométrica de la proteína se basa en la relación entre concentración y absorción de luz. Esto se conoce como la ley de Beer-Lambert, que establece que la concentración de una especie de absorción de luz es proporcional a la absorbancia.
Este principio es la base de todos los métodos de determinación fotométrica de la proteína.
Para el análisis de absorción directa, se miden los valores de absorbancia de las muestras inalteradas de la proteína. Debido a sus cadenas laterales aromáticas, residuos de triptófano y tirosina dan las lecturas de absorbancia máximas a una longitud de onda de 280 nm.
Sin embargo, estos aminoácidos, que son dos de los menos con frecuencia encontrados en las proteínas-son presentes en diferentes cantidades en cada proteína, así que cada determinación es único. Para superar esta limitación, ensayos más complejos-que no son dependientes de estos aminoácidos-fueron desarrollados.
Un ejemplo es el ensayo de Bradford, donde el tinte de color se agrega a la muestra. El tinte, conocido como azul de Coomassie, responde proporcionalmente la proteína más presente, los eventos de enlace más con el tinte.
Entonces, la concentración de proteína se determina midiendo la absorbancia del colorante azul de Coomassie encuadernado, que absorbe la luz en 594 nm. Sin embargo, el ensayo de Bradford es lineal en un rango corto de concentraciones, por lo que a menudo se requieren diluciones antes del análisis.
El método de Lowry combina el reactivo de Biuret, una solución alcalina de cobre iones que reaccionan con los enlaces peptídicos y el reactivo de Folin-Ciocâlteu, que oxida los residuos de proteína aromáticos. El cambio de color resultante de la muestra es proporcional a la concentración de proteína.
Puede determinar la absorbancia del reactivo de Folin reducido a 750 nm. Como absorción directa, cada proteína tiene una respuesta única y debe ser calibrado para la proteína de interés. Ahora que hemos analizado los principios básicos detrás de algunos de los ensayos más comunes, vamos a ver en directo cómo realizan la absorción y el ensayo de Bradford.
Para comenzar un análisis de absorción directa, el espectrofotómetro se calibra con un espacio en blanco para determinar cero absorbancia. Soluciones estándar son preparadas para usar en la creación de la curva de calibración. Entonces, una parte alícuota de la primera norma se añade a una cubeta y colocan en el espectrofotómetro.
El valor de absorbancia a 280 nm se registra a continuación. Este proceso se repite para cada estándar, usando una cubeta limpia para cada serie. Una vez finalizado, se crea una curva de calibración por representación de la absorbancia frente a concentración. La pendiente de esta recta es el coeficiente de atenuación molar, que relaciona la absorbancia concentración.
A continuación, la muestra desconocida se añade a una cubeta y se registra el valor de absorbancia. Como el análisis de datos para los métodos diferentes de determinación fotométrica es similar, cubriremos después nos fijamos en el ensayo de Bradford.
Aquí, el análisis de la proteína de Bradford se realiza con un estándar de BSA sobre una placa de 96 pocillos. Para empezar, se preparan soluciones acciones de BSA.
Las soluciones desconocidas se diluyen con agua desionizada para asegurar que las concentraciones dentro del intervalo del ensayo. Dependiendo del kit, el tinte Coomassie también puede requerir dilución. Entonces, la curva de calibración se configura mediante la adición de las normas de BSA a la placa de 96 pocillos.
Se añade agua desionizada para alcanzar la concentración necesaria para generar una curva estándar. La muestra desconocida se debe agregar al plato en triplicado para asegurar una medición exacta. Coomassie tinte siguiente se añade a cada pocillo, mezclar con la pipeta.
Agua desionizada se agrega a un pozo vacío como un espacio en blanco, para medir la absorbancia. Después de esperar 5 min para el tinte a enlazar, se mide la absorbancia en un lector de placa a 590 nm.
Ahora que hemos realizado unos pocos ensayos, echemos un vistazo a cómo analizar los datos. Cada método de determinación de proteína fotométrico se basa en la ley de Beer-Lambert.
La absorbancia medida de los estándares se utiliza para crear una curva de calibración, que se utiliza para determinar la concentración de muestras desconocidas. Esta curva puede ser trazada manualmente, aunque más nuevas herramientas espectrofotométricos creará la curva de calibración una vez que se han medido todas las normas. Estos sistemas también calculará la concentración de proteína como se analizan muestras desconocidas.
Ahora que hemos analizado cómo analizar datos de determinación de la proteína fotométrico, echemos un vistazo a algunas de las formas que se utilizan estos procedimientos.
Los principios de la determinación fotométrica de la proteína también pueden utilizarse para medir directamente la concentración de ácidos nucleicos. El espectrofotómetro nanodrop acepta muestras de volumen muy pequeño en un pedestal ópticamente activo. La absorbancia se mide, y el sistema determina automáticamente la concentración de ácidos nucleicos. Porque las proteínas y otras fuentes pueden interferir con las mediciones, pureza de la muestra se determina mediante el análisis de 260 a 280 nm y proporciones de absorbancia de 260 a 230 nm. Puros ácidos nucleicos típicamente producen proporciones de aproximadamente 1.8 y 2.0 aproximadamente para ADN y ARN, respectivamente.
Determinación fotométrica de la proteína puede también utilizarse en la producción de materiales biomiméticos, que se inspiran de la naturaleza para provocar respuestas celulares específicas. Adhesinas recombinantes están obligados a perlas de poliestireno para simular la fijación bacteriana a las células del huésped. El ensayo de Bradford se utiliza para determinar la eficiencia de acoplamiento de la recombinante adherencia a los granos en la producción de los materiales biomiméticos.
Ensayos alternativos proteína fotométrico pueden utilizarse en la detección y caracterización de agentes antimicrobianos de la proteína. Remazol brillante azul tinte de R está covalentemente a bacterias muertas por calor. La proteína antimicrobiana se incuba en la solución de teñido. A continuación, se centrifuga la muestra y la absorbancia del sobrenadante a 595 nm se mide mediante un espectrofotómetro para microplacas. Mayor absorbencia, por el tinte soluble en el sobrenadante de las bacterias marcadas, es una medida cuantitativa de la actividad enzimática.
Sólo ha visto video de Zeus sobre determinación fotométrica de la proteína. Este video describe los principios de determinación fotométrica fue sobre procedimiento general para algunos ensayos comunes y había cubierto algunos nuevos avances en las técnicas. ¡Gracias por ver!
Procedure
Disclosures
Transcript
Determining the concentration of a protein in samples is a fundamental step in many biochemical assays. Photometric determination can be done with small sample sizes. The more a sample contains light-absorbing substances, the less the light will transmit through it. This provides a quantitative measurement of the absorbing substances. These concepts are so fundamental to science that the articles that introduced two of the techniques are in the three most cited papers of all time. This video will show the concepts behind some of the most common photometric protein determination techniques, how they are performed, and how the gathered data is analyzed.
Photometric protein determination is based on the relationship between concentration and light absorbency. This is known as the Beer-Lambert Law, which states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance.
This principle underlies all photometric protein determination methods.
For direct absorption analysis, the absorbance values of unaltered protein samples are measured. Because of their aromatic side chains, tryptophan and tyrosine residues give the highest absorbance readings at a wavelength of 280 nm.
However, these amino acids-which are two of the least frequently found in proteins-are present in different amounts in every protein, so each determination is unique. To overcome this limitation, more complex assays-that are not dependent on these amino acids-were developed.
One example is the Bradford Assay, where colored dye is added to the sample. The dye, known as Coomassie Blue, responds proportionally-the more protein present, the more binding events with the dye.
Then, protein concentration is determined by measuring the absorbance of the bound Coomassie Blue dye, which absorbs light at 594 nm. However, the Bradford assay is linear over a short range of concentrations, so dilutions are often required before analysis.
The Lowry Method combines the Biuret reagent, an alkaline solution of copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Ciocâlteu reagent, which oxidizes aromatic protein residues. The resulting color change of the sample is proportional to the protein concentration.
The absorbance of the reduced Folin reagent can be determined at 750 nm. Like direct absorption, each protein has a unique response, and must be calibrated for the protein of interest. Now that we’ve reviewed the basic principles behind some of the most common assays, let’s look at how direct absorption and the Bradford assay are performed.
To begin a direct absorption analysis, the spectrophotometer is calibrated with a blank to determine zero absorbance. Standard solutions are prepared for use in creating the calibration curve. Then, an aliquot of the first standard is added to a cuvette, and placed into the spectrophotometer.
The absorbance value at 280 nm is then recorded. This process is repeated for each standard, using a clean cuvette for each run. Once complete, a calibration curve is created by plotting the absorbance versus concentration. The slope of this line is the molar attenuation coefficient, which relates absorbance to concentration.
Next, the unknown sample is added to a cuvette, and the absorbance value is recorded. As the data analysis for the different photometric determination methods is similar, we will cover that after we look at the Bradford assay.
Here, the Bradford protein assay is performed with a BSA standard on a 96-well plate. To begin, BSA stock solutions are prepared.
The unknown solutions are diluted with deionized water to ensure that the concentrations are within the assay’s range. Depending on the kit, the Coomassie dye may also require dilution. Then, the calibration curve is set up by adding the BSA standards to the 96-well plate.
Deionized water is added to reach the needed concentration to generate a standard curve. The unknown sample should be added to the plate in triplicates to ensure an accurate measurement is taken. Coomassie dye is next added to each well, mixing with the pipette.
Deionized water is added to an empty well as a blank, to measure the absorbance. After waiting 5 min for the dye to bind, the absorbance is measured in a plate-reader at 590 nm.
Now that we’ve performed a few assays, let’s look at how to analyze the data. Each photometric protein determination method is based on the Beer-Lambert Law.
The measured absorbance of the standards is used to create a calibration curve, which is then used to determine the concentration of unknown samples. This curve can be manually plotted, though newer spectrophotometric tools will create the calibration curve once all standards have been measured. These systems will also calculate protein concentration as unknown samples are analyzed.
Now that we’ve reviewed how to analyze photometric protein determination data, let’s look at some of the ways these procedures are utilized.
The principles of photometric protein determination can also be used to directly measure nucleic acid concentration. The nanodrop spectrophotometer accepts samples of very small volume onto an optically active pedestal. The absorbance is then measured, and the system automatically determines the nucleic acid concentration. Because proteins and other sources can interfere with measurements, sample purity is determined by analyzing the 260 to 280 nm and 260 to 230 nm absorbance ratios. Pure nucleic acids typically yield ratios of approximately 1.8 and approximately 2.0 for DNA and RNA, respectively.
Photometric protein determination can also be used in the production of biomimetic materials, which are inspired from nature to elicit specific cellular responses. Recombinant adhesins are bound to polystyrene beads to simulate bacterial attachment to host cells. The Bradford assay is used to determine the coupling efficiency of the recombinant adhesion to the beads in the production of the biomimetic material.
Alternative photometric protein assays can be used in the detection and characterization of protein antimicrobials. Remazol brilliant blue R dye is covalently bonded to heat-killed bacteria. The protein antimicrobial is incubated in the dyed solution. Then, the sample is centrifuged, and the absorbance of the supernatant at 595 nm is measured using a microplate spectrophotometer. Increased absorbance, by the soluble dye released into the supernatant from the labeled bacteria, is a quantitative measurement of enzymatic activity.
You’ve just watched JoVE’s video on photometric protein determination. This video described the underlying principles of photometric determination, went over general procedures for some common assays, and covered some new advances in techniques. Thanks for watching!
