Cancer Research
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts
Chapters
Summary June 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för isolering av tumör-initierande celler från humana sarkom-patientbaserade xenografter genom fluorescensaktiverad cell sortering, med humant leukocytantigen-1 (HLA-1) som en negativ markör, och för ytterligare validering och karakteriseringen av dessa HLA-1-negativa tumör-initierande celler.
Transcript
Vi upptäckte att HLA-I är epigenetically ner regleras i en subpopulation av cancerceller som uppvisar stamceller egenskaper och tumör-initierande kapacitet. HLA-I nedreglering är direkt relaterad till immun flykt, vilket ger överlevnad fördelar för cancer stamceller, därför gör HLA-I negativitet en korrekt funktionell markör för dessa celler. Demonstrera förfarandet kommer att Sudeh Izadmehr, en postdoc från vårt laboratorium.
Vid förvärvet av provet, placera vävnaden i en 100-millimeters Petri-skålen i en steriliserad bio säkerhetsskåp, och tillsätt 500 mikroliter av sterila PBS till skålen. Använd en steril skalpell för att mekaniskt triturera vävnaden i små bitar tills inget fragment är större än 0,1 millimeter. Överför hela 500-mikrolitervolymen av PBS genom en 35-mikrometer porcellsil till ett koniskt rör på 50 milliliter.
Tillsätt ytterligare 500 mikroliter pbs till vävnadsfragmenten och finhacka vävnaderna igen. Filtrera sedan supernatanten genom cellsilen i samma uppsamlingsrör, och fortsätt att finhacka vävnadsbitarna tills provet är helt dissocierat. När den sista volymen av celler har samlats in, snurra ner tumörcellerna genom centrifugeringen, och åter avbryta pelleten i fem milliliter av hemolys buffert.
Efter fem minuter i rumstemperatur, samla cellerna med en annan centrifugering, och tvätta pelleten med ytterligare fem milliliter PBS. Åter upphäva pelleten i en milliliter av PBS, och räkna livskraftiga celler. Späd cellerna till en en gånger 10 till de sjunde cellerna per 200 mikroliter av PBS koncentration på is, och tillsätt 200 mikroliter av källaren membran matris till cellerna med mild blandning.
Injicera sedan cellen suspension-källaren membran matris subkutant i flanken av en NOD scid gamma mus, och kontrollera tillväxten av tumören vid injektionsstället två gånger i veckan. När tumören når en centimeter i diameter, skär tumören i hälften, och fix hälften av xenograft med 4%paraformaldehyd över natten för histologisk analys. Bearbeta den andra halvan av tumören som just visat att uppnå en enda cell suspension, och späda cellerna till en två gånger 10 till de sex cellerna per milliliter PBS kompletteras med 5%FBS koncentration.
Underhåll cellerna på is i 30 minuter innan cellupphängningen mellan en isotypkontroll och ett antikroppsrör divideras. Notera antalet celler i varje rör, och blanda cellerna i antikroppsröret med anti-HLA-antikropp och cellerna i isotypkontrollröret med en lämplig anti-isotypkontrollantikropp för en 90-minuters inkubation på is. I slutet av inkubationen, samla båda cellpopulationerna genom centrifugeringen, följt av två 10-milliliter PBS tvättar genom centrifugeringen.
Efter den andra tvätten, åter upphäva pellets i 10 mikrogram per milliliter av DAPI till en gånger 10 till de sju cellerna per milliliter koncentration. Filtrera sedan varje cellupphängning genom en 35-mikrometer porsil till enskilda 12-by-75-millimeters polystyrenrör. Efter fluorescens-aktiverad cellsortering, späd HLA-I-negativa och positiva cellpopulationer till enskilda en gånger 10 till den femte cellkoncentrationerna i 15 milliliter av sarcosfärens tillväxtmedium per delmängd.
Seriellt späd cellerna till en gånger 10 till den fjärde, 10 till den tredje, och 10 till den andra koncentrationerna i 15 milliliter av färska sarcosfär tillväxt medium per spädning, och tillsätt 100 mikroliter celler från varje utspädning till varje brunn av en 96-väl ultra-låg fäst cellsodling tallrik per spädning. Placera plattorna i en 37-graders Celsius, 5% koldioxid cell kultur inkubator, övervaka sarcosphere bildning dagligen genom lätt mikroskopi och lägga till färska grundläggande fibroblast tillväxtfaktor och epidermal tillväxtfaktor till varje brunn utan att ändra mediet var tredje dag. Efter tre veckor, räkna antalet sarcosphere-positiva och sarcosphere-negativa brunnar för varje cell utspädning av både HLA-I-negativa och HLA-I-positiva celler för att möjliggöra beräkning av den sfärbildande cellfrekvensen baserat på en Poisson sannolikhetsfördelning.
Typiskt, mänskliga patient-härledda sarkom xenografts består av två distinkta HLA-I-positiva och negativa populationer, med en liknande histologi som visats av den föräldraprimär tumör. Fluorescence-aktiverad cell sortering av sarkom patient-härledda xenograft tumör-initiera celler som visat underlättar anrikning av ett högt antal HLA-I-negativa celler från den parental cell befolkningen. HLA-I-negativa celler kan bilda sfärer med en inledande ingång på så lite som 10 celler och uppvisar en högre tumör bilda förmåga än HLA-I-positiva sarkom patienten anlände xenograft tumör-initiera celler.
Injektion av samma antal HLA-jag negativa och positiva celler subkutant i motsatta flankerna av samma mus visar att HLA-I-negativa celler har en betydligt högre tumör bildas förmåga. Medan xenografts bildas av både HLA-I negativa och positiva subpopulationer är cellularly heterogena tumörer. Vidare, gen uttryck analys av tumör-initierande celler visar att HLA-I-negativa celler uttrycker stamceller differentiering markörer och kan induceras att differentiera längs både lipogena och osteogenic vägar, visar stark Oil-Red-O och Alizarin-Red-S färgning och kultur.
Denna metod kan användas för att isolera cancer stamceller i olika mänskliga cancerformer. Molekylär karbonisering, till exempel genom nästa generations sekvensering kan avslöja vanliga markörer för att rikta cellerna terapeutiskt. Vår upptäckt visar att återställandet av HLA-I är ett kritiskt steg för framgång en funktionell enhet immuncell augmentation strategier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
