Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography
Summary January 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.
Transcript
Huidige zymografische technieken detecteren een beperkt aantal proteasen. Fluorescerende peptide zymografie maakt gebruik van fluorescerende peptiden als het afbreekbare substraat dat het meten van een groter bereik van proteasen mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het modulaire ontwerp.
De volgorde van het fluorescerende peptide bepaalt welke proteasen worden gedetecteerd en het fluorescerende peptide kan gemakkelijk worden verwisseld met een peptide van een andere sequentie, een vermogen om andere proteasen te detecteren. Deze techniek kan helpen bij het ontwerp van peptiden's gebruik als afbreekbare cross-linkers in gemanipuleerde biomaterialen zoals die worden gebruikt voor de levering van geneesmiddelen of weefsel engineering toepassingen. Integratie van dit peptide in deze techniek kan weefsel gedetgeheimde proteasen identificeren die verantwoordelijk zijn voor biomateriële afbraak.
Demonstratie van deze techniek is belangrijk om de meerlaagse aanpak te visualiseren die uniek is in vergelijking met andere zymografietechnieken. Het aantonen van deze techniek zal zijn, Ameya Deshmukh, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid een 10%polyacrylamide oplossen gel oplossing zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol.
Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TEMED en APS toe. Vul vervolgens halverwege de 1,5 millimeter minigelcassette met de oplossende geloplossing. Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen.
Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de polyacrylamide in de buis volledig gestold is, is de reactie compleet. Terwijl de eerste oplossende gellaag polymeriseert, haalt u de Azido-PEG3-Maleimide-kit uit de opslag bij 20 graden Celsius en laat u de componenten op kamertemperatuur komen.
Los vervolgens de componenten van flacon twee op in het aanbevolen volume van DMSO van de fabrikant. En vortex voor 30 seconden om ervoor te zorgen dat de vloeistoffen goed gemengd zijn. Breng de inhoud van flacon een in een schone, droge 100 millileter ronde bodemkolf die een roerstaaf bevat.
Steek onmiddellijk een rubberen septumstopper met een diafragma dat met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Steek vervolgens twee 18-gauge spuitnaalden in het middenrif. Sluit een van de spuitnaalden aan op een inerte gastank en laat het gas de ronde bodemkolf gedurende drie minuten vullen.
Sluit vervolgens het inerte gas af en maak het los van de naald. Met behulp van een spuit, injecteer de volledige inhoud van flacon twee in de kolf. Verwijder zowel de naalden als de spuit.
Laat de componenten 30 minuten mengen bij kamertemperatuur tijdens het roeren. Verwijder hierna de rubberen septumstopper en breng de inhoud over naar een schone vijf milliliter centrifugebuis. Zodra de eerste oplossende gellaag heeft gepolymeriseerd giet de isopropanol laag.
Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Haal de thiol gefunctionaliseerde fluorescerende peptide uit de opslag op 80 graden Celsius. Laat het ontdooien bij kamertemperatuur.
Bereid een 10%resolving gel oplossing met de Azido-PEG3-Maleimide linker molecuul en de fluorescerende peptide zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul vervolgens de helft van het resterende gedeelte van de gelcassette met de peptide resolving gel oplossing.
Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Nadat de reactie is voltooid, giet de isopropanollaag af.
Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Als u de gels niet onmiddellijk gebruikt, bewaar ze dan door ze onder te dompelen in een plastic doos gevuld met 100 milliliter 1x PBS bij vier graden Celsius. Wikkel de doos in aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.
Bereid eerst een stapelgeloplossing van 5% voor, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul het resterende lege gedeelte van de gelcassette met de stapelgeloplossing.
Steek snel een 1,5 millimeter gelkam in de stapelen gel laag ervoor te zorgen dat er geen bubbels blijven gevangen onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de reactie is voltooid, verwijder dan voorzichtig de kam en de tape van de achterkant van de gelcassette.
Los om te beginnen monsters op in conventionele zymografiemonsterbuffer. Voeg 400 milliliter besturingssysteem 1X tris glycene SDS running buffer toe aan het gel apparaat. Laad tot 35 microliter monster per put.
Voer de monsters op 120 volt op vier graden Celsius gedurende anderhalf uur of totdat de moleculaire gewicht normen geven aan dat de proteases van belang zijn binnen de peptide-oplossende gel laag. Verwijder hierna de gels uit de plastic cassette. Was de gels drie keer in een herbenaringende buffer bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.
Bij elke wasbeurt van 10 minuten. Breng gels gedurende 15 minuten over naar een ontwikkelende bufferoplossing. Vervang vervolgens de oplossing door verse ontwikkelende buffer en incubeer bij 37 graden Celsius onder zachte agitatie gedurende 24 uur.
Gebruik hierna een fluorescerende gelscanner imager met de juiste excitatie- en emissiefilters om de gels in beeld te brengen. In deze studie naar fluorescerende protease afbreekbare peptiden zijn opgenomen in polyacrylamide gels. QGIW is een collageen een afgeleide sequentie ontworpen om cellulaire collagenesis te detecteren, terwijl LACW is een sequentie die is geoptimaliseerd voor de detectie van MMP-14 en MMP-11.
Fluorescerende beeldvorming onthult tal van banden binnen de LACW peptide gels, Terwijl slechts een enkele band wordt gezien in de QGIW gels. In vergelijking met gelatinezymografie zijn LACW-gels in staat om meer proteolytische banden te detecteren, wat het vermogen van peptide zymografie aantoont om een breder scala aan proteasen te detecteren die aanwezig zijn in biologische monsters dan traditionele methoden met behulp van inheemse substraten. Peptide zymografie cellen worden vervolgens geïncubeerd in de ontwikkeling buffer met ofwel GM6001, een breed spectrum MMP-remmer, of E64, een algemene cathepsin remmer.
Behandeling van de LACW peptide gels met GM6001, vermindert de intensiteit van de banden. Terwijl de behandeling met E64 geen waarneembaar effect heeft. Behandeling van de QGIQ peptide gels met GM6001 resulteert in volledige ablatie van de eerder vertoonde banden.
Terwijl E64 geen effect heeft. Gelatine zymografie wordt uitgevoerd met behulp van gezuiverde, geactiveerde MMP-9 om de gevoeligheid van peptide zymografie te vergelijken met de huidige gouden standaard. LACW gels zijn in staat om de kleinste concentraties MMP-9 te detecteren.
Proteases vereisen specifieke voorwaarden om de natuur te herstellen en geactiveerd te worden. Bereid de bufferoplossingen zorgvuldig voor om ervoor te zorgen dat de samenstelling en PH correct zijn. Deze methode kan worden aangevuld met bestaande technieken om de identiteit te verifiëren en verdere analyse van de gemeten proteasen uit te voeren.
Dit omvat westerse blotting, real-time PCR, en massaspectrometrie. Wees voorzichtig bij het hanteren van polyacrylamide. Ongepolymeriseerde oplossing wordt beschouwd als een krachtige neurotoxine en passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten altijd worden gedragen bij de behandeling ervan.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
