Medicine
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Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70
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Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.
Transcript
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nefrología sobre el papel de la permeabilidad glomerular en la enfermedad renal. La principal ventaja de esta técnica es que se detectan pequeños y transitorios aumentos de la permeabilidad glomerular mediante el uso de un trazador con plomo fluorescente etiquetado. Después de la anestesia, coloque un catéter urinario en el ratón femenino.
Coloque el ratón en la reclinación dorsal. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral. Obtener la parte de plástico del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubricarlo con gel de xylocaína.
Utilice el dedo índice izquierdo para colocar una tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen e introducir el catéter tres milímetros en el ostium uretral mientras se parale hacia el eje uretral distal. Gire la parte superior del angiocatéter 180 grados manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra. Luego, introduzca el catéter siete milímetros más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga.
Coloque un tubo marrón de 1,5 mililitros sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar un mililitro de 0,9% de cloruro de sodio por vía subcutánea para mejorar la producción de orina. Afeite el cuello del ratón y colóquelo en recumbencia con la cabeza hacia el cirujano.
Hyper extiende la cabeza del ratón con una cinta. Desinfectar el cuello con 70%isopropanol. Usando una pinza y un par de tijeras hacer una incisión de piel de cinco milímetros debajo de la mandíbula.
Corte la piel aproximadamente un centímetro en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón. Usa unas tijeras. Diseccione cuidadosamente la piel al lado derecho del cuello.
Haga una incisión rectangular de la piel a la derecha para exponer el tejido blando del cuello. Tenga cuidado de no dañar la vena yugular. Usa un par de tijeras y una pinza para fijar las solapas de la piel con dos abrazaderas.
Usando la punta de la pinza fina, exponga cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente. Si es necesario, retire el tejido con tijeras finas. Evite lesiones en las ramas de las venas.
Colocar y cerrar una ligadura con un hilo de seda en la parte distal de la vena yugular visible que está hacia la cabeza del ratón. Fije el hilo de seda con una cinta para poner tensión en la ligadura. Esto asegura una ligera tensión en la vena yugular.
Preparar una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular. Después de eso, llene el catéter con la solución de equilibrio y fusión. Fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular.
Control de burbujas para evitar la embolia aérea. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción. Alinee el tubo paralelo a la vena yugular y perfore la vena yugular apuntando al lumen.
Insertar para aproximadamente dos a cuatro milímetros en paralelo al eje de la vena yugular. Evite cualquier movimiento rápido. Cierre la ligadura para fijar el catéter.
Control de la estanqueidad de la ligadura mediante una visión cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía. Coloque el manguito de la cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se encuentra en la reclinación dorsal.
Inicie las mediciones y repítelas diez veces por punto de tiempo. Si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos, ajuste la posición del manguito de cola. Antes de la fase de equilibrio, cambie el tubo de recolección urinaria y colóquelo sobre hielo.
Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter del recipiente pequeño que se introduce en la vena yugular. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de un mililitro llena con el bolo FITC al final del catéter del vaso pequeño.
Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC de 100 microlitrotro. Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Vuelva a abrir la abrazadera e inicie la bomba de la jeringa con un caudal de 0,008 mililitros por minuto.
Continúe la perfusión durante 60 minutos. En esta fase, se investigan los fármacos eficaces sobre la selectividad de la perm glomerular. Cambie el tubo urinario del punto de tiempo cero minuto a otro tubo marrón de 1,5 mililitros.
Coloque un hisopo alrededor del catéter del vaso pequeño y desconecte el catéter grande del catéter del vaso pequeño. Llene la jeringa con la solución de fase experimental. Colóquelo en la bomba de la jeringa y deje que la bomba de perfusión funcione para que el catéter grande se llene con la solución de fase experimental.
Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de la jeringa a un caudal de 0,008 mililitros por minuto. Continúe ejecutando la bomba de jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces.
Coloque el tubo de orina sobre hielo. En este estudio, la exploración por fluorescencia de orina nativa de ratón muestra un pico de 395 nanómetros. La polisurosa FITC 70 a una concentración de 40 microgramos por mililitro en orina de ratón muestra un máximo de fluorescencia a 525 nanómetros.
La orina del ratón no altera la medición de fluorescencia de la polisurosa FITC 70. A la admisión de 525 nanómetros el aumento de las concentraciones de polisuquida FITC 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Este método también es capaz de detectar diferencias en la permeabilidad glomerular.
Las columnas blancas representan la polisuquida FITC 70 niveles antes del inicio de la estimulación de la angiotensina II en la fase experimental. Después de dosis durante 60 minutos, la permeabilidad glomerular aumentó en comparación con el grupo de control. la angiotensina II lamina reduce la permeabilidad glomerular.
Los niveles de polisuquida FITC 70 disminuyeron después de 60 minutos adicionales de estimulación de la angiotensina II o 60 minutos de lavado con angiotensina II. El aumento de la permeabilidad glomerular debido a la angiotensina II podría ser bloqueado por un bloqueador de receptores de angiotensina II. La presión arterial monitoreada por el método del manguito de cola no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con control y angiotensina II.
Al intentar este procedimiento es importante evitar la embolia de aire al cambiar las soluciones de perfusión.
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Medicina Número 150 Permeabilidad glomerular polisucrosa trazador albúmina catéter urinario del ratón catéter venoso central del ratón diafragma de hendidura gloméruloRelated Videos
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