מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

פסאודומונס ארוגינוזה הוא פתוגן ברמה BSL-2. זכור לעקוב אחר כל נוהלי הבטיחות ברמת BSL-2 בעת טיפול באורגניזם זה. כאן נדגים בידוד תאים ראשוני, במבחנה phagocytosis, וניתוח מסלול phagocytic, ו vivo phagocytosis והערכה סיווג חיידקי בעכברים.

מסירה תוך-יצ’בית מוצלחת דורשת תרגול כדי לשלוט. ודא כי microsprayer טעון כראוי, המחט היא בין שני קפלי הקול, ואת מהירות הבוכנה נשלטת כראוי. התחל על ידי אבטחת העכבר בתחנה supine עם הגפיים להתפשט על לוח ניתוח מכוסה מגבות נייר משדלת חוט מתחת לשיניים הקדמיות כדי לסגת את הראש, כך קנה הנשימה ממוקם ישר ברמה.

לחטא את העכבר עם 70% אתנול ולהשתמש מטלטולים רגילים כדי למשוך את העור בקו המרכזי של הגוף. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את העור מהבטן לראש הגרון. השתמש בקצה הקהה של מספריים כירורגיים סטנדרטיים כדי לנתח בזהירות את שריר הגרון ורקמות החיבור.

פתח את דופן הבטן מתחת לצלעות. חותכים את הסרעפת, וחותכים את החלק התחתון של בית החזה כדי לחשוף חלקית את הריאות. השתמש מספריים באביב כדי לחשוף את קנה הנשימה ולהשתמש במטסים לתפוס טבעת סחוס.

השתמש מספריים מיקרו בזהירות לעשות חתך כ 1.5 מילימטר על פני הגחון של קנה הנשימה. בזהירות מחרוזת אורך קצר של חוט תפר מתחת קנה הנשימה ולהכניס 18 מד cannula לתוך קנה הנשימה. כאשר cannula הוא במקום, בעדינות לשטוף את הריאה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS טרי לכל לשטוף, בעדינות למשוך את הנוזל לתוך המזרק לפני reinfusing אותו בחזרה לתוך הריאה במשך שלוש פעמים ברציפות.

לאחר כל לשון, להעביר את נוזל lavage bronchoalveolar שנאסף או BALF לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה של הנוזל שנקטף הכולל. אפשרו מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של PBS טרי לצנטריפוגה שנייה והשקיעו מחדש את מקרופאגים מכתשים שנשטפו לשני מיליליטר של נסיוב בקר העוברי המשונה של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי שאינו מושבת בחום. ואז להעביר את מקרופאגים מים ראשוניים לצלחת פטרי תחתית זכוכית לתרבות שלהם יומיים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תא.

לאחר 48 שעות, לשטוף את התרבות עם מיליליטר אחד של PBS לפני האכלת התרבות עם שני מיליליטר של מדיום טרי. לאחר מכן, הוסיפו לתרבות 50 חרוזים בקוטר 2 מיקרומטר עם לטוקסידות מסוג FITC לתא עבור דגירה של שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תאים. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת בהרחבה חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS טרי לכל לשטוף כדי להסיר את חרוזים חוץ תאיים באופן אקראי תמונה 100 תאים לספור את התאים המכילים חרוזי תאיים.

לצורך בדיקה אופוסוניזציה, דגירה פעמיים 10 כדי כבשים השמינית כדוריות דם אדומות או SRBCs עם 50 microliters של ארנב נגד SRBC אימונוגלובולין M או IgM במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הדגירה SRBCs opsonized עם 50 microliters של סרום אנושי C5 לקוי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לתקן את C3b ו C3b מעכבי להשלים שברים על SRBCs מצופה IgM. לאחר מכן, שאפו את המדיה והוסיפו 100 מיקרוליטרים של 10 פעמים לשבעת ה-SRBCs האופוסוניים למיליליטר של מדיום לכל באר של צלחת של 96 בארות המכילה פי 10 למאקרופאגים המורין המתורבים בן הלילה הרביעיים לבא.

הדגירה את coculture מקרופאג עכבר SRBC במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר את SRBCs מאוגד על ידי שטיפה עם 100 microliters של מאגר אשלגן אמוניום כלורי אשלגן במשך דקה אחת. לאחר הסרת SRBCs לא מאוגדים, לשטוף עם 100 microliters של מדיה. Lyse התאים הנותרים עם 0.1% נתרן dodecyl סולפט ולטפל lysates עם 50 microliters של 2, 7-diaminofluorene בתוספת 3%מי חמצן ושש אוריאה טוחנת.

לאחר מכן למדוד את הספיגה של היווצרות כחול פלואורן המוגלובין-קטליז על ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר. השתמש בעקומה סטנדרטית בערכי ספיגת ננומטר של 620 עם מספר ידוע של SRBCs כדי לקבוע את מספר ה- SRBCs האופוסוניים המרוכזים ב- phagocytized. כדי להעריך phagocytosis מתווך קולטן זיהוי דפוס, לשטוף יומיים מתורבת עכבר מכתש ראשוני מקרופאגים עם מיליליטר אחד של PBS ולטפל בתאים עם 500 microliters של מדיום טרי המכיל 100 אלקסה פלואור-488 גדילן Zymosan-A-bioparticles.

לאחר שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את phagocytosis עם 500 microliters של PBS קר כקרח ולשטוף את התאים בהרחבה חמש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף את התאים חמש פעמים נוספות כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, לכסות את התאים עם 500 microliters של PBS טרי עבור הדמיה תחת ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ערוץ פלואורסצנטי ב 488 ננומטר כדי לכמת את מספר מקרופאגים Zymosan-A-bioparticle המכיל מכתש.

עבור להערכת phagocytosis מקרופאג מכתב vivo, לאשר את הרמה המתאימה של הרדמה על ידי חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה ולמקם את העכבר על לוח שטוח עם חוט פלסטיק מתחת החותכים העליונים. מניחים את העכבר ב rostrum שקע למחצה ב 45 מעלות מיקום עם משטח הגחון פונה כלפי מעלה ולהשתמש מדפים מעוגלים לשלוף ולדכא את הלשון. לאחר מכן הכנס microsprayer בין קפלי הקול לנהל תוך מאמץ 50 microliters של חמש פעמים 10 לשש יחידות יוצרות המושבה של P.aeruginosa GFP לתוך הריאות של החיה הרדמה.

כדי לאשר כי מחט microsprayer הוא קנה הנשימה, בעדינות להזיז את המזרק ולהתבונן קפלי הקול משני צדי המחט. שעה לאחר הזיהום, לאסוף את נוזל lavage כפי שהוכח רק גלולה מקרופאגים alveolar על ידי צנטריפוגה. תן שימוש חוזר פעם אחת 10 לתאים השלישיים ב 100 microliters של PBS טרי עבור cytocentrifuge על מגלשת זכוכית.

ואז להכתים באופן דיפרנציאלי את שקופיות cytospun עבור מקרופאגים מכתים, נויטרופילים, ולימפוציטים, על פי הפרוטוקולים ההיסטוכימיים הסטנדרטיים. בחר באופן אקראי 100 מקרופאגים מכתרים כדי לכמת את אחוז התאים כי phagocytosed חיידקים. בניסוי הראשון בסיווג חיידקים vivo, להזריק תוך רחף מנה sublethal של כ 2.5 עד חמש פעמים 10 יחידות המושבה החמישית להרכיב למיליליטר של P.aeruginosa לתוך סוג הבר מורדם עכברים מוטנטים ולמדוד את משקל הגוף של כל חיה כל יום במשך שישה ימים.

בניסוי השני, להזריק קבוצה חדשה של סוג פראי ועכברים מוטנטים עם קטלני שלוש פעמים 10 לשבע יחידות יוצרות המושבה למנה מיליליטר של P.aeruginosa ולתזמן את התמותה בתוך יומיים של זריקה, איסוף רקמת הריאה כולה בזמן המוות או יומיים לאחר הזריקה לכמת את נטל חיידקי הריאות בשיא הזיהום. לאחר קצירת הריאות, חותכים את דגימות הריאה לחתיכות קטנות על הקרח ומהומוגנים את שברי הריאה באמצעות הגדרת הומוגניזציה חשמלית מותאמת. ואז צלחת 100 microliters של הומוגונט על פסאודומונס בידוד אגר צלחות בדילול סדרתי 10-פי.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מגלה כי מקרופאגוזיס מכתש ראשי של העכבר של חרוזי לטקס FITC מתרחשת לאחר שעה אחת של דגירה, עם מקרופאגים נוקאאוט TRIM72 המדגימים יכולת phagocytic גבוהה משמעותית. לעומת זאת, לחץ יתר של TRIM72, חלבון עם פונקציה לא ידועה בתאי מקרופאג מורין, גורם לירידה של יותר מחמישה פי חמישה בפאגוציטוזיס המשלים. אלקסה פלואור-488 יציבה חלקיקי Zymosan-A, עם זאת, הם לבלוע בכמות שווה על ידי מקרופאגים מכתליים ראשוניים מבודדים מסוג פראי או עכברי נוקאאוט.

כתמים דיפרנציאליים של BALF שנקטפו מבעלי חיים פראיים ונוקאאוט חושפים מספר דומה של מקרופאגים אך יכולת phagocytic גבוהה יותר עבור המקרופאגים שנקטפו מעכברי נוקאאוט. יתר על כן, עכברי נוקאאוט TRIM72 להפגין התאוששות מהירה יותר של משקולות הגוף שלהם, לשמור על הישרדותם, ולהפגין נטל חיידקי נמוך יותר מאשר בעלי חיים מסוג בר לאחר ניהול P.aeruginosa תוך-חוץ-תאי. באמצעות טכניקה זו, תהליכים phagocytic אחרים החשובים לדלקת ריאות כגון נויטרופילים phagocytosis ואת התרומה היחסית של phagocytes אחרים סיווג חיידקים ניתן לנתח.

בשילוב עם מעכבי פרמקולוגיים, העברה אדפטיבית ובעלי חיים מהועברים, טכניקה זו יכולה לעזור לחוקרים לחקור את המרכיב המולקולרי של סוג מסוים של phagocytosis עבור phagocytes של עניין.