Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

O protocolo que Liz desenvolveu nos permite determinar a taxa de fertilização da mosca branca. A aplicação dessa técnica melhorará nossa compreensão do comportamento e ecologia das moscas brancas. Moscas brancas são haplodiploides, então a taxa de fertilização é igual à razão sexual em oviposition.

Este protocolo é o primeiro descrito para moscas brancas, ao nosso conhecimento, e pode ser concluído dentro de três horas. Para começar, faça um furo de cobertura na tampa da placa de Petri para inserir e remover as moscas brancas adultas. Configure uma câmara de umidade e modele uma sonda inserindo um pino fino em um ângulo de trabalho confortável em uma ponta de pipeta derretida para fazer uma sonda fina.

Opcionalmente, alonge as pontas de pipeta de vidro com calor para facilitar o manuseio de ovos de mosca branca. Em seguida, deixe as moscas brancas fêmeas ovipositar em uma folha limpa, cortada para caber em ágar em uma placa de Petri. Durante a oviposição da mosca branca, limpe um slide de microscópio com água e sabão.

Seque-o bem e estique um pedaço de filme de parafina sobre uma extremidade para permitir que líquidos formem gotas e ovos sejam mais facilmente vistos. Para descorrionato de ovos, use uma pipeta pasteur de vidro para adicionar gotas de 83% de solução de alvejante hipoclorito de sódio ao filme de parafina logo antes da remoção adulta e coleta de óvulos. Alvejante e ácido acético glacial sãorosivos.

Eles devem ser manuseados com luvas em um capô ou área bem ventilada. DAPI também é irritante e deve ser manuseado com luvas. Em seguida, remova as moscas brancas adultas da folha e coloque a folha sob um microscópio.

Retire cuidadosamente cada ovo de sua base até que o pedicel seja removido da folha. Pratique em muitos ovos antes de realizar este protocolo. Levante os ovos lentamente da base e levante-o completamente da folha uma vez que você pode ver que o pedicel de ovo é removido da folha.

Transfira de dois a três ovos para cada gota de alvejante e deixe-os por 10 minutos. Para fixar os ovos, use uma pipeta de vidro para descartar a alvejante. Em seguida, adicione gotas de ácido acético glacial e espere três minutos.

Em seguida, remova o ácido acético glacial e adicione gotas da solução de Clarke. Então, espere 10 minutos até que a maior parte da solução tenha evaporado. Adicione gotas de 70% de etanol e espere novamente por 10 minutos.

Para manchar os ovos, primeiro remova qualquer etanol residual. Em seguida, adicione gotas de 1xPBS aos ovos para obter o pH perto de sete. Coloque o deslizamento do microscópio em uma câmara de umidade para evitar a dessacação.

Após 30 minutos, remova o 1xPBS e adicione gotas de 1 microgramas por DAPI mililitro. Coloque o deslizamento do microscópio em uma câmara de umidade escura e espere pelo menos 15 minutos. Para lavar ovos, primeiro remova a solução DAPI.

Em seguida, adicione gotas de 1xTBST aos ovos. Após cinco minutos, remova o 1xTBST. Repita esta lavagem mais duas vezes para um total de três lavagens.

Após a lavagem final, pipeta cuidadosamente todos os ovos do parafilme em uma parte limpa do slide do microscópio. Remova o excesso de TBST e adicione 20 microliters de mídia de montagem. Por fim, coloque um slide de cobertura limpa em cima dos ovos, sele o slide da tampa com esmalte transparente para armazenamento a longo prazo e prossiga para a imagem usando um microscópio fluorescente.

A descorção de óvulos seguida de coloração nuclear DAPI permitiu a atribuição de fertilização e sexo embrião quando observada com um microscópio fluorescente. O pronucleu feminino está perto do centro do óvulo fêmea fertilizado e do óvulo macho não fertilizado, e o espermatozoide é visível como uma raia brilhante perto do ápice apenas do óvulo feminino. Uma aplicação desta técnica é determinar se os endossímbiontos bacterianos afetam as relações sexuais primárias dos moscas brancas.

Por exemplo, as proporções sexuais primárias dos ovos colocados por moscas B.tabici não infectadas por Rickettsia e não infectadas não mostraram diferença significativa entre a razão sexual nos dois tratamentos. Quanto aos ovos criados até a idade adulta, resultados semelhantes foram observados para adultos infectados por Rickettsia e não infectados, não fornecendo evidências, pelo menos neste estudo, para maiores taxas de fertilização por fêmeas infectadas por Rickettsia. Usando este protocolo, pode-se determinar se o esperma interespecífico pode fertilizar óvulos.

Se nenhuma fertilização for observada, pode-se recuar e ver se o esperma é transferido durante o acasalamento olhando na espermatozoide da fêmea. Se a fertilização ocorrer, pode-se comparar a razão sexual dos adultos com a taxa de fertilização para determinar a viabilidade do desenvolvimento da prole híbrida.