Bestemme Egg befruktning Rate av Bemisia tabaci med en Cytogenetic teknikk

Protokollen som Liz utviklet tillater oss å bestemme whitefly befruktning rate. Bruk av denne teknikken vil forbedre vår forståelse av whiteflies oppførsel og økologi. Whiteflies er haplodiploid, så befruktningshastigheten er lik kjønnsforholdet ved oviposisjon.

Denne protokollen er den første som er beskrevet for whiteflies, så vidt vi vet, og kan fullføres innen tre timer. Til å begynne med, lag et skjult hull i petriskåldekselet for å sette inn og fjerne de voksne hvitefluene. Sett opp et fuktighetskammer og mote en sonde ved å sette inn en tynn pin i en komfortabel arbeidsvinkel i en smeltet pipettespiss for å lage en tynn sonde.

Eventuelt forlenge glass pipette tips med varme for enklere håndtering av whitefly egg. Deretter la kvinnelige hvitefluer oviposit på et rent blad, kuttet for å passe på agar i en petriskål. Under whitefly oviposisjonen, rengjør et mikroskop lysbilde med såpe og vann.

Tørk den godt og strekk et stykke parafinfilm over den ene enden for å tillate væsker å danne dråper og egg for å bli lettere å se. For å deshorionere egg, bruk et glass Pasteur pipette for å legge til dråper av 83% natriumhypokloritt blekemiddel løsning til parafin filmen rett før voksen fjerning og egg samling. Blekemiddel og isetdiksyre er begge etsende.

De bør håndteres med hansker i en hette eller godt ventilert område. DAPI er også irriterende og bør håndteres med hansker. Fjern deretter de voksne whiteflies fra bladet og legg bladet under et mikroskop.

Løft forsiktig hvert egg fra basen til pedicelen er fjernet fra bladet. Øv på mange egg før du utfører denne protokollen. Løft eggene sakte fra basen og løft det helt av bladet når du kan se at eggstam pedicelen fjernes fra bladet.

Overfør to til tre egg til hver dråpe blekemiddel og la dem stå i 10 minutter. For å fikse eggene, bruk en glasspipette til å kaste blekemiddelet. Deretter legger du til dråper glacial eddiksyre og venter tre minutter.

Deretter fjerner du isen eddiksyre og legger til dråper clarkes løsning. Deretter venter du 10 minutter til det meste av løsningen har fordampet. Legg til dråper på 70% etanol og vent igjen i 10 minutter.

For å flekke eggene, fjern først eventuell gjenværende etanol. Deretter legger du til dråper på 1xPBS til eggene for å få pH nær syv. Sett mikroskopet gli i et fuktighetskammer for å hindre uticcation.

Etter 30 minutter, fjern 1xPBS og legg til dråper på 1 mikrogram per milliliter DAPI. Sett mikroskopet gli i et mørkt fuktighetskammer og vent minst 15 minutter. For å vaske egg, først fjerne DAPI-løsningen.

Legg deretter dråper 1xTBST til eggene. Etter fem minutter, fjern 1xTBST. Gjenta denne vasken to ganger til for totalt tre vasker.

Etter den endelige vasken pipetter du forsiktig alle eggene fra parafilmen på en ren del av mikroskopet. Fjern overflødig TBST og tilsett 20 mikroliter monteringsmedier. Til slutt plasserer du et rent dekselsklie på toppen av eggene, forsegler dekselet med klar neglelakk for langsiktig lagring, og fortsett til avbildning ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.

Egg dechorionation etterfulgt av DAPI kjernefysisk farging tillot tildeling av befruktning og embryo sex når observert med et fluorescerende mikroskop. Den kvinnelige pronucleus er nær sentrum av både det befruktede kvinnelige egget og ufruktbar mannlig egg, og sæden er bare synlig som en lys strek nær toppen av det kvinnelige egget. En anvendelse av denne teknikken er å avgjøre om bakterielle endymbionter påvirker primære kjønnsforhold mellom hvitefluer.

For eksempel viste de primære kjønnsforholdene av egg lagt av Rickettsia-infiserte og uinfiserte B.tabici whiteflies ingen signifikant forskjell mellom kjønnsforhold i de to behandlingene. Som for egg oppdratt til voksen alder, lignende resultater ble sett for Rickettsia-infiserte og uinfiserte voksne, gir ingen bevis, i hvert fall i denne studien, for større befruktning priser av Rickettsia-infiserte kvinner. Ved å bruke denne protokollen kan man avgjøre om interspesifikk sæd kan befrukte egg.

Hvis ingen befruktning observeres, kan man sikkerhetskopiere og se for å se om sædceller overføres under parring ved å se i kvinnens spermatheca. Hvis befruktning oppstår, kan man sammenligne kjønnsforholdet til voksne med befruktningshastigheten for å bestemme levedyktigheten til hybrid avkomutvikling.