Neuroscience
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成人希马神经前体细胞的乳化电路特定调节
Chapters
Summary July 24th, 2019
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该协议的目的是描述一种分析成人神经干细胞/祖细胞行为的方法,以响应特定局部神经回路的化学遗传学操作。
Transcript
该协议可以回答大脑中的各种回路如何调节成人神经生成，特别是刺激或抑制神经回路如何影响成人神经干细胞的增殖。这种技术的优点是，它能够专门瞄准所需的神经回路，并减少引入给动物的应力量。这种方法可以提供洞察不同的大脑回路如何调节成人神经发生，特别是释放某些神经递质的特定细胞类型如何调节成人神经干细胞增殖。
要开始此过程，请将组织部分放在 PBS 中，然后按顺序从前到后顺序在带正带的幻灯片上安装五到八个部分。让组织部分在室温下干燥两到五分钟，并完全粘附在幻灯片上。接下来，在容器中准备柠檬酸盐缓冲区。
在微波炉中加热柠檬酸盐缓冲液五分钟，直到溶液沸腾。同时，将安装部分放在玻璃滑架中。五分钟后，小心地将带部分的滑动支架放入移液器盒中。
将微波炉的电源设置为 50%，烹饪时间设置为 7 分钟。启动计时器 7 分钟，并监视解决方案。当溶液开始沸腾时，停止微波炉，并在煮沸停止后继续微波炉。
计时器用完后停止，即使微波炉上的烹饪时间尚未完成。此步骤的目标是将水保持在沸点温度以下，而不让水过度沸腾。煮沸太多会从幻灯片中去除组织部分。
然后，将带柠檬酸盐缓冲液的暖盒和组织滑到冰桶中进行冷却。盖上盒子，等待约30分钟，或直到溶液冷却触摸，然后再继续到胸腺素模拟染色。要用胸腺素模拟染色组织部分，请从柠檬酸盐缓冲液中去除组织部分。
让组织部分干燥并完全粘附在幻灯片上，然后使用疏水笔绘制边框。接下来，用渗透缓冲液渗透各部分 20 到 30 分钟。每次使用 TBS-triton 清洗两次，每次五分钟。
然后，准备一个Edu反应解决方案。孵育Edu反应溶液中的部分30分钟至1小时。随后，在 TBS-triton 中清洗三次，每次五分钟。
用铝箔盖住幻灯片，或将它们放在受光线保护的室内，以防止在此步骤后受到光线的光。在此阶段，使用荧光显微镜检查 Edu 反应是否有效。如果反应有效，应观察有教育标记的细胞。
现在，使用与二次抗体在同一动物中培养的阻塞缓冲液阻断安装的组织部分，30分钟到1小时。然后，每次用 TBS-triton 洗两次，每次五分钟。在阻断步骤中，通过混合阻断缓冲液中的原抗体来准备原抗体溶液。
随后，每张幻灯片添加250微升原抗体溶液，以确保组织部分完全淹没，并在室温下孵育过夜。第二天，用TBS-triton清洗组织部分三次，每次洗涤五分钟，以去除多余的原抗体。然后，在室温下在阻断缓冲液中培养在阻断缓冲液中准备的氟磷结合二级抗体中的组织部分两个小时。
在TBS-triton中清洗组织部分三次，每次五分钟，以去除多余的二级抗体。接下来，在 PBS 中应用 300 微摩尔 DAPI 溶液，在室温下应用 1 到 100 分钟，15 分钟。之后，在PBS中清洗组织部分三次，每次五分钟，以去除多余的DAPI，并使用棉签去除组织周围的PAP笔圈。
在应用安装介质并盖上盖玻片之前，请让各部分干燥。使用成像软件，将每个凹痕陀螺部分的图像打开为复合图像，通道以不同颜色合并，以便于可视化共体化。然后，使用多边形选择工具测量每个部分中凹痕陀螺的面积，并记录每个鼠标的所有部分。
这将是用于计算密度的凹陷陀螺的面积。使用插件细胞计数器在插件下找到，分析，细胞计数器，细胞计数器，记录在凹陷陀螺的细胞数量，具有结肠原抗体和胸腺素模拟Edu从复合图像。此外，使用径向过程记录 Edu 阳性和嵌套阳性细胞的总数。
在巢中，关注细胞的形态是非常重要的。如果量化神经干细胞，请确保只有具有径向过程的细胞被量化。在电子表格软件中输入单元格计数，以编译所有数据以在以后进行分析。
例如，为了获得干细胞密度，将巢状阳性细胞和水蛋白细胞的总和除以每个动物的凹陷陀螺体积之和。假设每个步骤都是一微米，通过将面积与总 Z 步长增量相乘来计算每个部分的体积。在此协议中，总步骤应接近 40，因为组织被分切在 40 微米。
随后，计算增殖细胞的总数、增殖神经干细胞的百分比以及刺激反边青苔细胞后的总增殖细胞。通过使用胸腺素模拟Eddu和抗原检索的巢渍，增殖神经干细胞成功地标记。此外，通过省略抗原检索步骤，Tbr2阳性神经祖细胞和神经细胞和DCX阳性神经细胞和不成熟的神经元被标记。
下面是一个量化并用于计算细胞密度的区域的示例，下面是幻灯片上安装组织的示例。显示成功实验和低于标准的实验进行比较。最后，从成功的实验中可以获得几种不同的量化。
定量包括增殖神经干细胞的密度、增殖神经干细胞的百分比、总增殖细胞和总干细胞池。在青苔细胞的反向刺激下，观察到神经干细胞增殖的减少。这个过程中最重要的一步是控制微波炉中的组织沸腾。
如果煮得太久，组织部分就会受损。遵循这个程序后，可以注射不同的病毒载体，以目标相同的电路。例如，如果一个人正在刺激神经回路，一个人可以抑制它使用抑制性DD一病毒。
该协议中介绍的技术并不新颖。然而，这个协议的优势在于它全面涵盖了回答电路如何影响成人神经生成的问题所需的所有步骤。
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