Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen
Chapters
Summary July 24th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.
Transcript
Dit protocol kan beantwoorden hoe verschillende circuits in de hersenen volwassen neurogenese reguleren en specifiek hoe stimulerende of remmende neurale circuits de proliferatie van volwassen neurale stamcellen beïnvloeden. Het voordeel van deze techniek is dat het in staat is om specifiek gericht gewenste neurale circuits, evenals het verminderen van de hoeveelheid stress geïntroduceerd bij de dieren. Deze methode kan inzicht geven in hoe verschillende hersencircuits volwassen neurogenese reguleren, in het bijzonder, hoe specifieke celtypen die bepaalde neurotransmitters vrijgeven, de proliferatie van volwassen neurale stamcellen reguleren.
Om deze procedure te beginnen, plaats de weefselsecties in PBS en monteer vijf tot acht secties op een positief geladen dia in seriële volgorde van voorste naar achterste. Laat de weefselsecties twee tot vijf minuten drogen bij kamertemperatuur en houd zich volledig aan de glijbanen. Bereid vervolgens de citratebuffer in een container voor.
Verwarm de citraatbuffer in een magnetron gedurende vijf minuten totdat de oplossing kookt. Plaats ondertussen de gemonteerde delen in een glazen schuifhouder. Plaats de schuifhouder na vijf minuten voorzichtig met de secties in een pipettendoos.
Zet de magnetron stroom op 50%en de kooktijd op zeven minuten. Start een timer gedurende zeven minuten en controleer de oplossing. Stop de magnetron wanneer de oplossing begint te koken, en zet de magnetron na het koken stopt.
Stop nadat de timer afloopt, zelfs als de kooktijd op de magnetron nog niet is afgelopen. Het doel van deze stap is om het water onder de kooktemperatuur te houden zonder het water overdreven te laten koken. Te veel koken zal verwijderen weefselsecties van de dia.
Breng vervolgens de warme doos met citraatbuffer en weefselglijbanen over naar een ijsemmer om af te koelen. Bedek de doos, en wacht ongeveer 30 minuten of totdat de oplossing is cool aan te raken, voordat u overgaat tot thymidine analoge kleuring. Om de weefselsecties met thymidine analoog te bevlekken, verwijder de weefselsecties van de citraatbuffer.
Laat de weefselsecties drogen en volledig hechten aan de dia's, voordat u een rand trekt met een hydrofobe pen. Vervolgens permeabiliseren van de secties met permeabilisatie buffer voor 20 tot 30 minuten. Was de secties twee keer met behulp van TBS-triton gedurende vijf minuten per keer.
Bereid vervolgens een Edu-reactieoplossing voor. De secties in Edu-reactieoplossing gedurende 30 minuten tot een uur uitbroeden. Vervolgens, was ze drie keer in TBS-triton voor vijf minuten per keer.
Bedek de glijbanen in aluminiumfolie, of plaats ze in een licht beveiligde kamer om te beschermen tegen licht na deze stap. Controleer in dit stadium of de Edu-reactie werkt met behulp van een fluorescerende microscoop. Edu-gelabelde cellen moeten worden geobserveerd als de reactie werkt.
Nu, blokkeer de gemonteerde weefselsecties met behulp van blokkerende buffer verhoogd in hetzelfde dier als het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten tot een uur. Was ze dan twee keer in tbs-triton gedurende vijf minuten per keer. Bereid tijdens de blokkeringsstap de primaire antilichaamoplossing voor door het primaire antilichaam te mengen in de blokkeringsbuffer.
Voeg vervolgens 250 microliter primaire antilichaamoplossing per dia toe om ervoor te zorgen dat de weefselsecties volledig onder water staan en broed ze 's nachts uit bij kamertemperatuur. De volgende dag, was de weefselsecties drie keer in TBS-triton gedurende vijf minuten elk om overtollig primair antilichaam te verwijderen. Vervolgens, incubeer de weefselsecties in fluorofofofore-geconjugeerde secundaire antilichaam bereid in het blokkeren van buffer oplossing voor twee uur bij kamertemperatuur.
Was de weefselsecties drie keer in TBS-triton gedurende elk vijf minuten om overtollig secundair antilichaam te verwijderen. Breng vervolgens 300 micromolar DAPI-oplossing aan bij één tot 100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Daarna, was de weefselsecties drie keer in PBS gedurende vijf minuten elk om overtollige DAPI te verwijderen, en verwijder de PAP pen cirkel rond het weefsel met behulp van een wattenstaafje.
Laat de secties drogen, voordat u montagemedia aanbrengt en ze bedekt met coverslips. Open met behulp van de beeldsoftware het beeld van elke dentate gyrussectie als samengestelde afbeelding met de kanalen die in verschillende kleuren zijn samengevoegd om de colocalisatie eenvoudig te visualiseren. Meet vervolgens het gebied van dentate gyrus in elke sectie met behulp van het gereedschap veelhoekselectie en neem alle secties van elke muis op.
Dit zal het gebied van dentate gyrus worden gebruikt om de dichtheid te berekenen. Met behulp van de software plugin cel teller gevonden onder Plugins, Analyseren, Celteller, Cell Counter, record het aantal cellen in de dentate gyrus die colocalizing primaire antilichaam en thymidine analoge Edu uit de samengestelde afbeelding. Bovendien registreert u het totale aantal Edu-positieve en nestinepositieve cellen met een radiaal proces.
In het geval van nestine is het erg belangrijk om aandacht te besteden aan de morfologie van de cellen. Als het kwantificeren van neurale stamcellen, zorg ervoor dat alleen cellen met een radiaal proces worden gekwantificeerd. Voer de celtellingen in een spreadsheetsoftware in om alle gegevens voor analyse later samen te stellen.
Bijvoorbeeld, om de stamceldichtheid te verkrijgen, verdeel de som van nestin-positieve en Edu-positieve cellen door de som van dentate gyrus volume in elk dier. Bereken het volume van elke sectie door het gebied te vermenigvuldigen met de totale Z-stap stappen, ervan uitgaande dat elke stap is een micrometer. In dit protocol moeten de totale stappen dicht bij 40 zijn, omdat weefsel op 40 micrometer wordt gesectied.
Bereken vervolgens het totale aantal vermenigvuldigende cellen, procent van de vermenigvuldigende neurale stamcellen en de totale vermenigvuldigende cellen na het stimuleren van contralaterale mossige cellen. Door het gebruik van een thymidine analoge Edu en antigeen ophalen voor de nestin kleuring, werden de prolifererende neurale stamcellen met succes gelabeld. Bovendien, door het weglaten van de antigeen retrieval stap, Tbr2-positieve neurale voorloper en neuroblast en DCX-positieve neuroblas en onvolwassen neuronen werden gelabeld.
Hier is een voorbeeld van het gebied gekwantificeerd en gebruikt om celdichtheid te berekenen, en hier is een voorbeeld van het gemonteerde weefsel op een dia. Zowel succesvolle als sub-par experimenten worden getoond voor vergelijking. Ten slotte zijn er verschillende kwantificeringen die kunnen worden verkregen uit een succesvol experiment.
De kwantificering omvat de dichtheid van zich vermenigvuldigende neurale stamcellen, het percentage vermenigvuldigende neurale stamcellen, totale vermenigvuldigende cellen en de totale stamcelpool. Bij contralaterale stimulatie van mossige cellen werd een afname van neurale stamcelproliferatie waargenomen. De belangrijkste stap in deze procedure is het controleren van weefsel koken in de magnetron.
De weefselsecties worden beschadigd als ze te lang koken. Na het volgen van deze procedure, kan men verschillende virale vectoren injecteren om hetzelfde circuit te targeten. Bijvoorbeeld, als men het stimuleren van een neuraal circuit, kan men remmen met behulp van een remmende DREADD virus.
De technieken die in dit protocol worden gepresenteerd zijn niet nieuw. Echter, de kracht van dit protocol is dat het uitgebreid alle stappen die nodig zijn voor het beantwoorden van vragen over hoe circuit effecten volwassen neurogenese omvat.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
