Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
आसीबिंग सर्किट वयस्क हिप्पोकैम्पस तंत्रिका precursor कोशिकाओं के विशिष्ट विनियमन
Chapters
Summary July 24th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक विशिष्ट स्थानीय तंत्रिका सर्किट के chemogenetic हेरफेर के जवाब में वयस्क तंत्रिका स्टेम / जनक कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन है.
Transcript
यह प्रोटोकॉल जवाब दे सकता है कि मस्तिष्क में विभिन्न सर्किट वयस्क न्यूरोजेनेसिस को कैसे विनियमित करते हैं और विशेष रूप से तंत्रिका सर्किट को उत्तेजित या बाधित करने से वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रसार पर प्रभाव पड़ता है। इस तकनीक का लाभ यह है कि यह विशेष रूप से वांछित तंत्रिका सर्किट को लक्षित करने में सक्षम है, साथ ही जानवरों के लिए शुरू किए गए तनाव की मात्रा को कम करता है। यह विधि इस बारे में जानकारी प्रदान कर सकती है कि विभिन्न मस्तिष्क सर्किट वयस्क न्यूरोजेनेसिस को कैसे विनियमित करते हैं, विशेष रूप से, कैसे विशिष्ट कोशिका प्रकार जो कुछ न्यूरोट्रांसमीटर जारी करते हैं वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार को विनियमित करते हैं।
इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पीबीएस में ऊतक वर्गों को रखें और पूर्वकाल से पीछे तक सीरियल क्रम में सकारात्मक रूप से चार्ज स्लाइड पर पांच से आठ वर्गों को माउंट करें। ऊतक वर्गों को दो से पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें और स्लाइड्स का पूरी तरह पालन करें। इसके बाद, एक कंटेनर में साइट्रेट बफर तैयार करें।
सिट्रेट बफर को माइक्रोवेव ओवन में पांच मिनट के लिए गर्म करें जब तक कि समाधान उबल न जाए। इस दौरान घुड़सवार सेक्शन को शीशे की स्लाइड होल्डर में रखें। पांच मिनट के बाद, ध्यान से स्लाइड धारक को वर्गों के साथ एक पिपेट बॉक्स में रखें।
माइक्रोवेव ओवन पावर को 50% और कुक टाइम को सात मिनट तक सेट करें। सात मिनट के लिए एक टाइमर शुरू करें, और समाधान की निगरानी करें। माइक्रोवेव ओवन बंद करो जब समाधान उबलना शुरू होता है, और उबलते बंद हो जाता है के बाद माइक्रोवेव जारी है ।
टाइमर समाप्त होने के बाद बंद करो, भले ही माइक्रोवेव पर कुक समय समाप्त नहीं हुआ है। इस चरण का लक्ष्य पानी को उबलते तापमान के ठीक नीचे रखना है, बिना पानी को उबालने दें। बहुत ज्यादा उबलते स्लाइड से ऊतक वर्गों को दूर करेगा।
फिर, ठंडा करने के लिए एक बर्फ बाल्टी के लिए साइट्रेट बफर और ऊतक स्लाइड के साथ गर्म बॉक्स स्थानांतरित करें। बॉक्स को कवर करें, और लगभग 30 मिनट तक या जब तक समाधान स्पर्श करने के लिए ठंडा न हो, थायरिडीन एनालॉग धुंधला करने के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रतीक्षा करें। थाइमिडीन एनालॉग के साथ ऊतक वर्गों को दागने के लिए, साइट्रेट बफर से ऊतक वर्गों को हटा दें।
एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ एक सीमा खींचने से पहले ऊतक वर्गों को सूखने दें और स्लाइडों का पूरी तरह से पालन करें। इसके बाद, 20 से 30 मिनट के लिए पारशीलीकरण बफर के साथ वर्गों को पार करें। हर बार पांच मिनट के लिए टीबीएस-ट्राइटन का उपयोग करके अनुभागों को दो बार धोएं।
इसके बाद एडु रिएक्शन सॉल्यूशन तैयार करें। एडु रिएक्शन सॉल्यूशन में सेक्शन को 30 मिनट से एक घंटे तक इनक्यूबेट करें। इसके बाद, उन्हें हर बार पांच मिनट के लिए टीबीएस-ट्राइटन में तीन बार धोएं।
एल्यूमीनियम पन्नी में स्लाइड कवर, या इस कदम के बाद प्रकाश से बचाने के लिए उन्हें एक प्रकाश संरक्षित कक्ष में जगह है। इस स्तर पर, जांचें कि क्या एडु प्रतिक्रिया फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके काम करती है। यदि प्रतिक्रिया काम करती है तो एडू-लेबल कोशिकाओं को देखा जाना चाहिए।
अब, एक घंटे के लिए 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही जानवर में उठाया अवरुद्ध बफर का उपयोग कर घुड़सवार ऊतक वर्गों ब्लॉक । इसके बाद उन्हें हर बार पांच मिनट के लिए टीबीएस-ट्राइटन में दो बार धोएं। अवरुद्ध चरण के दौरान, बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी को मिलाकर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
इसके बाद, ऊतक वर्गों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए प्रति स्लाइड प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, ऊतक वर्गों को टीबीएस-ट्राइटन में तीन बार पांच मिनट के लिए धोएं ताकि अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाया जा सके। फिर, कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए बफर समाधान को अवरुद्ध करने में तैयार फ्लोरोफोर-कंजूज्ड माध्यमिक एंटीबॉडी में ऊतक वर्गों को इनक्यूबेट करें।
ऊतक वर्गों को टीबीएस-ट्राइटन में तीन बार पांच मिनट के लिए धोएं ताकि अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को हटाया जा सके। इसके बाद, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में एक से 100 पर 300-माइक्रोमोलर DAPI समाधान लागू करें। इसके बाद, अतिरिक्त DAPI को हटाने के लिए पांच मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार ऊतक वर्गों को धोएं, और एक कपास झाड़ू का उपयोग करके ऊतक के चारों ओर पीएपी पेन सर्कल को हटा दें।
बढ़ते मीडिया को लागू करने और उन्हें कवरस्लिप के साथ कवर करने से पहले वर्गों को सूखने दें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्रत्येक डेंटेट जाइरस सेक्शन की छवि को एक समग्र छवि के रूप में खोलें, जिसमें चैनलों को आसानी से कोलोकैलाइजेशन की कल्पना करने के लिए अलग-अलग रंगों में विलय किया गया है। फिर, बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके प्रत्येक खंड में डेंटेट जाइरस के क्षेत्र को मापें, और प्रत्येक माउस के सभी वर्गों को रिकॉर्ड करें।
यह घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेंटेट जाइरस का क्षेत्र होगा। प्लगइन्स, एनालिसिस, सेल काउंटर, सेल काउंटर के तहत पाए जाने वाले सॉफ्टवेयर प्लगइन सेल काउंटर का उपयोग करके, डेंटेट जाइरस में कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें जिसमें समग्र छवि से प्राथमिक एंटीबॉडी और थायरिडीन एनालॉग एडु को कोलोकैलाइज किया गया है। इसके अतिरिक्त, रेडियल प्रक्रिया के साथ एडु-पॉजिटिव और नेस्टिन-पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या रिकॉर्ड करें।
नेस्टिन के मामले में, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान पर ध्यान देना बहुत महत्वपूर्ण है। यदि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करते हैं, तो सुनिश्चित करें कि केवल एक रेडियल प्रक्रिया वाली कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित की गई है। बाद में विश्लेषण के लिए सभी डेटा संकलित करने के लिए एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में सेल मायने रखता है दर्ज करें ।
उदाहरण के लिए, स्टेम सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक जानवर में डेंटेट जाइरस मात्रा के योग से नेस्टिन-पॉजिटिव और एडु-पॉजिटिव कोशिकाओं के योग को विभाजित करें। कुल जेड-चरण वेतन वृद्धि के साथ क्षेत्र को गुणा करके प्रत्येक खंड की मात्रा की गणना करें, यह मानते हुए कि प्रत्येक चरण एक माइक्रोमीटर है। इस प्रोटोकॉल में, कुल चरण 40 के करीब होने चाहिए क्योंकि ऊतक 40 माइक्रोमीटर पर अनुभागित है।
इसके बाद, प्रजनन कोशिकाओं की कुल संख्या, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का प्रसार करने का प्रतिशत, और कॉन्ट्रालेटरल मॉसी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के बाद कुल प्रसार कोशिकाओं की गणना करें। नेस्टिन स्टेनिंग के लिए थायरिडीन एनालॉग एडु और एंटीजन रिट्रीवल का उपयोग करके, प्रसार तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को सफलतापूर्वक लेबल किया गया था। इसके अतिरिक्त, एंटीजन पुनः प्राप्ति कदम को छोड़ कर, Tbr2-सकारात्मक तंत्रिका जनक और न्यूरोब्लास्ट और डीसीएक्स-पॉजिटिव न्यूरोब्लास्ट और अपरिपक्व न्यूरॉन्स को लेबल किया गया था।
यहां निर्धारित क्षेत्र का एक उदाहरण है और सेल घनत्व की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है, और यहां एक स्लाइड पर घुड़सवार ऊतक का एक उदाहरण है। तुलना के लिए सफल और उप-बराबर दोनों प्रयोग दिखाए जाते हैं। अंत में, कई अलग-अलग मात्राएं हैं जिन्हें एक सफल प्रयोग से प्राप्त किया जा सकता है।
मात्रात्मक रूप से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का प्रसार करने का घनत्व, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का प्रसार करने का प्रतिशत, कुल प्रसार कोशिकाएं और कुल स्टेम सेल पूल शामिल हैं । काई कोशिकाओं की विपरीत उत्तेजना पर, तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार में कमी देखी गई। इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम माइक्रोवेव ओवन में उबलते ऊतक को नियंत्रित करना है।
ऊतक वर्गों क्षतिग्रस्त हो जाएगा अगर वे बहुत लंबे समय के लिए उबलते हैं। इस प्रक्रिया का पालन करने के बाद, एक ही सर्किट को लक्षित करने के लिए विभिन्न वायरल वैक्टर इंजेक्ट कर सकता है। उदाहरण के लिए, यदि कोई तंत्रिका सर्किट को उत्तेजित कर रहा था, तो कोई इसे एक निरोधात्मक खतरनाक वायरस का उपयोग करके रोक सकता है।
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत तकनीक उपन्यास नहीं हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की ताकत यह है कि यह व्यापक रूप से इस बारे में सवालों के जवाब देने के लिए आवश्यक सभी चरणों को शामिल करता है कि सर्किट वयस्क न्यूरोजेनेसिस को कैसे प्रभावित करता है।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
