Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Assaying Circuit spesifikk regulering av voksen hippocampus neural forløper Cells
Chapters
Summary July 24th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Målet med denne protokollen er å beskrive en tilnærming for å analysere atferden til voksen neural Stem/stamceller som svar på chemogenetic manipulering av en bestemt lokal nevrale krets.
Transcript
Denne protokollen kan svare på hvordan ulike kretser i hjernen regulerer voksen nevrogenese og spesielt hvordan stimulerende eller hemmende nevrale kretser påvirker spredningen av voksne nevrale stamceller. Fordelen med denne teknikken er at den er i stand til å spesifikt målrette ønskede nevrale kretser, samt redusere mengden stress introdusert til dyrene. Denne metoden kan gi innsikt i hvordan ulike hjernekretser regulerer voksen nevrogenese, spesielt hvordan spesifikke celletyper som frigjør visse nevrotransmittere regulerer voksen neural stamcellespredning.
For å starte denne prosedyren, plasser vevseksjonene i PBS og monter fem til åtte seksjoner på et positivt ladet lysbilde i seriell rekkefølge fra fremre til bakre. La vevsseksjonene tørke ved romtemperatur i to til fem minutter og hold deg helt til lysbildene. Deretter klargjør du citratebufferen i en beholder.
Varm citratbufferen i en mikrobølgeovn i fem minutter til oppløsningen kokes. I mellomtiden plasserer du de monterte delene i en glassglideholder. Etter fem minutter plasserer du forsiktig glideholderen med seksjonene i en pipetteboks.
Sett strøm i mikrobølgeovnen til 50 %, og koketiden til syv minutter. Start en tidtaker i syv minutter, og overvåk løsningen. Stopp mikrobølgeovnen når oppløsningen begynner å koke, og fortsett mikrobølgeovnen etter at kokende stopp.
Stopp etter at tidtakeren er ute, selv om koketiden på mikrobølgeovnen ikke er ferdig. Målet med dette trinnet er å holde vannet rett under kokende temperatur uten å la vannet koke altfor. For mye koking vil fjerne vevsseksjoner fra lysbildet.
Deretter overfører du den varme boksen med citrate buffer og vev glir til en isbøtte for kjøling. Dekk boksen, og vent i ca 30 minutter eller til løsningen er kul å ta på, før du går videre til thymidin analog farging. For å flekke vevseksjonene med thymidinanalog, fjern vevsseksjonene fra citratbufferen.
La vevsseksjonene tørke og hold seg helt til lysbildene, før du tegner en kant med en hydrofob penn. Deretter gjennomsyrer du seksjonene med permeabiliseringsbuffer i 20 til 30 minutter. Vask seksjonene to ganger med TBS-triton i fem minutter hver gang.
Deretter forbereder du en Edu-reaksjonsløsning. Inkuber seksjonene i Edu reaksjonsløsning i 30 minutter til en time. Deretter vasker du dem tre ganger i TBS-triton i fem minutter hver gang.
Dekk lysbildene i aluminiumsfolie, eller legg dem i et lysbeskyttet kammer for å beskytte mot lys etter dette trinnet. På dette stadiet, sjekk om Edu-reaksjonen virker ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Edu-merkede celler bør observeres hvis reaksjonen virker.
Nå blokkerer de monterte vevsseksjonene ved hjelp av blokkeringsbufferen hevet i samme dyr som det sekundære antistoffet i 30 minutter til en time. Vask dem deretter to ganger i TBS-triton i fem minutter hver gang. Under blokkeringstrinnet klargjør du primær antistoffløsning ved å blande det primære antistoffet i blokkeringsbufferen.
Deretter legger du til 250 mikroliter primær antistoffløsning per lysbilde for å sikre at vevsseksjonene er helt nedsenket, og inkubere dem over natten ved romtemperatur. Neste dag, vask vevseksjonene tre ganger i TBS-triton i fem minutter hver for å fjerne overflødig primært antistoff. Deretter inkubere vevsseksjonene i fluoroforkonjugert sekundært antistoff tilberedt i å blokkere bufferløsning i to timer ved romtemperatur.
Vask vevsseksjonene tre ganger i TBS-triton i fem minutter hver for å fjerne overflødig sekundært antistoff. Deretter påfør 300 mikromolar DAPI-løsning på en til 100 i PBS i 15 minutter ved romtemperatur. Etterpå vasker du vevsseksjonene tre ganger i PBS i fem minutter hver for å fjerne overflødig DAPI, og fjerner PAP-pennesirkelen rundt vevet ved hjelp av en bomullspinne.
La seksjonene tørke, før du bruker monteringsmedier og dekker dem med dekkglass. Ved hjelp av bildeprogramvaren åpner du bildet av hver bulkegyrusseksjon som et sammensatt bilde med kanalene slått sammen i forskjellige farger for enkelt å visualisere kolokaliseringen. Deretter måler du området for bulker gyrus i hver seksjon ved hjelp av polygonvalgverktøyet, og registrerer alle delene av hver mus.
Dette vil være området av bulkete gyrus som brukes til å beregne tettheten. Ved hjelp av programvare plugin celle telleren funnet under Plugins, Analyser, Cell Counter, Cell Counter, registrere antall celler i dentate gyrus som har colocalizing primære antistoff og thymidine analog Edu fra sammensatt bilde. I tillegg registrerer du totalt antall Edu-positive og nestinpositive celler med en radial prosess.
Når det gjelder nestin, er det svært viktig å ta hensyn til cellenes morfologi. Hvis kvantifisere nevrale stamceller, sørg for at bare celler med en radial prosess kvantifiseres. Skriv inn celleantallet i en regnearkprogramvare for å kompilere alle dataene for analyse senere.
For eksempel, for å oppnå stamcelletettheten, del summen av nestinpositive og Edu-positive celler med summen av bulkete gyrusvolum i hvert dyr. Beregn volumet for hver del ved å multiplisere området med totale Z-trinns intervaller, forutsatt at hvert trinn er ett mikrometer. I denne protokollen bør totale trinn være nær 40 siden vev er seksjonert ved 40 mikrometer.
Deretter beregner du det totale antallet proliferaterende celler, prosent av spredning av nevrale stamceller og totalt voksende celler etter å ha stimulert kontralaterale mosseceller. Ved å bruke en tyromidin analog Edu og antigen gjenfinning for nestin farging, de proliferating nevrale stamceller ble vellykket merket. I tillegg, ved å utelate antigen gjenfinning trinn, Tbr2-positiv neural stamfar og neuroblast og DCX-positiv neuroblast og umodne nevroner ble merket.
Her er et eksempel på området kvantifisert og brukes til å beregne celletetthet, og her er et eksempel på det monterte vevet på et lysbilde. Både vellykkede og sub-par eksperimenter vises for sammenligning. Til slutt er det flere forskjellige kvantifiseringer som kan fås fra et vellykket eksperiment.
Kvantifiseringene inkluderer tettheten av voksende nevrale stamceller, prosentandelen av voksende nevrale stamceller, totale proliferating celler, og den totale stamcelleutvalget. Ved kontralateral stimulering av mosseceller ble det observert en reduksjon i spredning av nevrale stamceller. Det viktigste trinnet i denne prosedyren er å kontrollere vevskoking i mikrobølgeovnen.
Vevsseksjonene vil bli skadet hvis de koker for lenge. Etter å ha fulgt denne prosedyren, man kunne injisere ulike virale vektorer for å målrette den samme kretsen. For eksempel, hvis man var stimulerende en nevrale krets, man kan hemme den ved hjelp av en hemmende DREADD virus.
Teknikkene som presenteres i denne protokollen er ikke nye. Styrken i denne protokollen er imidlertid at den dekker omfattende alle trinnene som kreves for å svare på spørsmål om hvordan krets påvirker voksen nevrogenese.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
