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线虫的耗氧率测定
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Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

线虫的耗氧率测定

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08:10 min

February 23, 2019

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08:10 min
February 23, 2019

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线粒体功能对细胞平衡至关重要,氧气消耗率是线粒体健康的决定性指标。该协议提供了分析C.elegans中氧气消耗率的详细说明。该协议利用实时移动C.elegans提供线粒体功能的法律测量。

提升隔离线粒体需求,这一步骤可能影响线粒体的完整性。首先,将所需遗传背景的L4幼虫转移到线虫生长介质或NGM板上新鲜播种的大肠杆菌草坪上。每个应变至少使用两个 100 mm 或三个 60 mm 板。

在适当的生长温度下孵育蠕虫三到四天,或直到板与大量的鸡蛋和麦格虫集中。每100毫米线虫板用大约6毫升的M9缓冲液将鸡蛋和蠕虫从盘子里洗掉。使用玻璃牧场移液器,将鸡蛋和蠕虫转移到每个菌株的15毫升离心管中。

在6,180克下旋转这些管三分钟。离心后,吸出M9缓冲液,只保留动物和蛋丸。在每个管中加入三到四毫升的漂白剂溶液,间歇性涡流6分钟。

然后,加入M9缓冲液填充每个管,并在6,180克旋转一分钟。吸上一液,用M9重复洗涤三次。洗涤后,将鸡蛋颗粒移动到含有约9毫升M9缓冲液的新鲜15毫升管中。

在 20 摄氏度下加热 16 至 48 小时,使新孵化的蠕虫同步。在将这些管子在 6,180 g 下旋转 1.5 分钟后,将同步的 L-1 动物放在单个 NGM 板上的 OP50 新鲜种子草坪上。将板保持在20摄氏度,直到动物在大约42小时后到达L-4幼虫阶段。

此时,使用铂金选择将L4幼虫移至OP50种子NGM板,每毫升FUdR含有0.5毫克,以防止产生后代。通过将 200 微升蒸馏水添加到板上的每一个井中,使传感器墨盒水合一,确保传感器探头被淹没。在室温下隔夜存放板。

关闭呼吸计界面内的加热元件。将机器存放在 15 摄氏度的培养箱内可降低机器内部的核心温度,并防止动物在检测过程中过热。经过一夜的孵化,移液器取出并丢弃用于滋润传感器探头的蒸馏水,并在每井中用200微升的校准液代替。

将 FCCP 库存溶液稀释至蒸馏水中的 100 微摩尔 FCCP。然后,将稀释溶液的 20 微升添加到传感器墨盒中的喷射端口 A 中。将 22 微升 400 毫摩尔钠 azides 添加到传感器墨盒的喷射端口 B 中。

现在,打开呼吸仪。在主屏幕上,选择”开始”,将显示模板页面。在模板页上,选择空白”或以前设计的模板。

将显示组页面。在组页上,选择井 A 和 H 作为背景井,根据实验计划将剩余的六口井分配到适当的组中。通过单击右下角的箭头访问协议页,并确保选择平衡、基底和注入一和两个按钮。

调整基础OCR的读数数以及最大OCR和非线粒体OCR。选择右下角的箭头。将显示加载传感器墨盒板的提示。

按照提醒提示屏幕上的说明,确保传感器墨盒板以正确的方向加载。现在,重新测量仪将平衡墨盒。在细胞板的八个孔和周围储液罐中,每口加入200微升M9缓冲液。

从每个菌株中挑选大约 100 个蠕虫到非种子 NGM 板上,并允许休息两到三分钟。然后,用M9缓冲液将铂金采摘的端子弄湿,将20岁同步动物放入B型水井到G型,使背景井 A和H空空。现在,单击呼吸仪软件上的”确定”以弹出包含校准缓冲液的板。

从呼吸仪上拆下板,将传感器盒留在仪器内。用含有动物的盘子替换卡钳板。加载板并通过撞击关闭车门,然后让检测运行。

检测运行完成后,按照屏幕上的提示删除电池板和传感器盒。将闪存驱动器插入 USB 端口以保存运行数据战格式。拆下传感器墨盒,让动物在井底安顿下来约两分钟。

将细胞板放在立体解剖显微镜下,计算每孔的动物数量。打开分析软件,然后打开规范化选项卡,将耗氧率与动物数量标准化。在”修改”选项卡下为各个组应用适当的级别,并导出该文件作为棱镜文件进行进一步分析。

前五个测量值的平均值是基础 OCR。添加 FCCP 后五个测量值的平均值为最大 OCR。最后,添加亚兹德钠后最后五次测量的平均数是非线粒体呼吸率。

由于钙失调会导致线粒体功能改变,因此对sel-12突变体和野生类动物的OCR进行测量,以检查sel-12突变对线粒体功能和健康的影响。野生类动物的底法OCR率一直低于每分钟5个皮毛,每个蠕虫。虽然所有三个菌株的sel-12突变体显示显著升高的OCR,大约每分钟7个皮科,每个蠕虫。

加入FCCP后,野生类型的OCR和sel-12突变体如预期的那样增加。野生类动物显示,每只蠕虫每分钟最大OCR约为7个象形虫。而 sel-12 突变体每分钟有大约 10 个象形虫,每个蠕虫。

在此测定中使用活体、喂养良好和异步动物,并避免将鸡蛋或尸体转移到测定井中。此外,仪器的内部温度不应超过 25 摄氏度。漂白剂、FCCP、FudR 和酸钠是有毒的。

因此,在准备库存溶液和药物装载时,应注意佩戴防护手套。

Summary

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线粒体呼吸对组织的生存至关重要;因此, 耗氧率是线粒体健康的一个很好的指标。在这个协议中, 我们描述了使用一个商业上可用的呼吸计来测量基本和最大耗氧率活, 完整, 和自由运动的。

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