Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondriale functie is van cruciaal belang voor cellulaire homeostase en zuurstofverbruik is een beslissende indicator van mitochondriale gezondheid. Dit protocol geeft gedetailleerde instructies voor het analyseren van het zuurstofverbruik in C.elegans. Dit protocol maakt gebruik van live, mobiele C.elegans die een wettelijke meting van mitochondriale functie.

Het verhogen van de noodzaak om mitochondriën te isoleren, een stap die potentieel effect kan hebben op zijn integriteit. Om te beginnen, breng L4 larven van gewenste genetische achtergronden over op een vers ingezaaid gazon van Escherichia coli op nematode groeimedia of NGM-platen. Gebruik voor elke stam ten minste twee platen van 100 mm of drie platen van 60 mm.

Broed de wormen drie tot vier dagen bij de juiste groeitemperatuur, of totdat de platen zijn geconcentreerd met een groot aantal eieren en gravidwormen. Was de eieren en wormen van de platen met ongeveer 6 milliliter M9 buffer per 100 millimeter plaat van aaltjes. Met behulp van glazen weide pipetten, breng de eieren en wormen in individuele 15 milliliter centrifuge buizen voor elke stam.

Draai de buizen van de stellingen drie minuten naar beneden op 6, 180 g. Na centrifugatie, aspirate uit de M9 buffer behoud van alleen het dier en ei pellet. Voeg drie tot vier milliliter bleekmiddel oplossing aan elke buis en met tussenpozen vortex gedurende zes minuten.

Voeg vervolgens M9-buffer toe om elke buis te vullen en draai gedurende een minuut op 6, 180 g. Aspirate de supernatant en herhaal deze was met de M9, drie keer. Verplaats na de was de eierpellet naar een verse buis van 15 milliliter met ongeveer negen milliliter M9-buffer.

Synchroniseer de vers uitgebroede wormen door 16 tot 48 uur te nuteren bij 20 graden Celsius. Na het spinnen van deze buizen naar beneden op 6, 180 g gedurende 1,5 minuten, zet de gesynchroniseerde L-1 dieren neer op een vers ingezaaid gazon van OP50 op individuele NGM platen. Houd de platen op 20 graden Celsius totdat de dieren na ongeveer 42 uur het larvale stadium van L-4 bereiken.

Gebruik op dit moment een platina pick om de L4 larven te verplaatsen naar OP50 gezaaide NGM-platen met 0,5 milligram per milliliter FUdR om te voorkomen dat het nageslacht produceert. Hydrateer de sensorcartridge door 200 microliter gedestilleerd water aan elke put op de plaat toe te voegen, zodat de sensorsondes onder water komen te staan. Bewaar de platen ‘s nachts op kamertemperatuur.

Schakel het verwarmingselement in de respirometer-interface uit. Het opslaan van de machine in een 15 graden Celsius incubator verlaagt de kerntemperatuur in de machine en voorkomt dat de dieren oververhit raken tijdens de test. Na nachtelijke incubatie, pipet uit en gooi het gedestilleerde water gebruikt om de sensor sondes hydrateren, en vervang het door 200 microliters van de calibrant oplossing in elke put.

Verdun de FCCP-voorraadoplossing tot 100 micromolar FCCP in gedestilleerd water. Voeg vervolgens 20 microliter van de verdunde oplossing toe aan injectiepoort A in de sensorcartridge. Voeg 22 microliter van 400 millimolar natriumanikides toe aan injectiepoort B van de sensorcartridge.

Zet nu de respirometer aan. Selecteer start op het startscherm en de sjabloonpagina’s worden weergegeven. Selecteer op de pagina sjablonen leeg of een eerder ontworpen sjabloon.

De groepspagina wordt weergegeven. Selecteer op de groepspagina de putten A en H als achtergrondputten en wijs de resterende zes putten toe aan geschikte groepen volgens het experimentele plan. Toegang tot de protocolpagina door op de pijl rechtsonder te klikken en ervoor te zorgen dat de knop gelijk, basaal en injecties één en twee worden geselecteerd.

Pas het aantal metingen van basale OCR aan, evenals maximale OCR en niet-mitochondriale OCR. Selecteer de pijl rechtsonder. Er verschijnt een prompt om de sensorcartridgeplaat te laden.

Zorg ervoor dat de sensorcartridgeplaat in de juiste richting wordt geladen en volg de instructies op het herinneringspromptscherm. De respirameter zal nu de cartridge in evenwicht brengen. Voeg 200 microliter M9 buffer in elk van de acht putten en de omliggende reservoirs van de celplaat.

Kies ongeveer 100 wormen van elke stam op ongeplaatste NGM-platen en laat twee tot drie minuten rusten. Maak vervolgens het einde van de platina pick met M9-buffer nat en kies 20 leeftijdsgesynchroniseerde dieren in putten B tot en met G, waardoor de achtergrondputten A en H leeg blijven. Klik nu op OK op de respirometersoftware om de plaat met kalibratiebuffer uit te werpen.

Haal de plaat uit de respirometer, waardoor de sensorcartridge in het instrument blijft zitten. Vervang de remklauwplaat door de plaat met de dieren. Laad platen en sluit de deur door te raken blijven en laat de test te lopen.

Zodra de test is voltooid, volg de aanwijzingen op het scherm om de celplaat en sensorcartridge te verwijderen. Plaats een flashdrive in de USB-poort om de run data war-indeling op te slaan. Verwijder de sensorcartridge en laat de dieren zich ongeveer twee minuten tot de bodem van de putten nestelen.

Plaats de celplaten onder een stereoontledenmicroscoop en tel het aantal dieren per put. Open de analysesoftware, gevolgd door het normalisatietabblad, om het zuurstofverbruik te normaliseren tot het aantal dieren. Pas de juiste niveaus toe voor de verschillende groepen onder het tabblad Wijzigen en exporteer het bestand als prismabestand voor verdere analyse.

Het gemiddelde van de eerste vijf metingen is de basale OCR. Het gemiddelde van de vijf metingen na FCCP toevoeging is de maximale OCR. Ten slotte is het gemiddelde van de laatste vijf metingen na natriumadetoevoeving de niet-mitochondriale ademhalingssnelheid.

Aangezien calciumontregeling kan leiden tot een veranderde mitochondriale functie, werd OCR bij zowel de sel-12 mutanten als wilde diersoorten gemeten om het effect van sel-12 mutaties op mitochondriale functie en gezondheid te onderzoeken. Wilde diersoorten vertoonden consequent basale OCR-tarieven van minder dan vijf picomoles per minuut, per worm. Terwijl alle drie stammen van sel-12 mutanten significant verhoogde OCR, van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm toonden.

Na de toevoeging van FCCP, was er een toename van de OCR van wilde type, evenals sel-12 mutanten, zoals verwacht. Wilde diersoorten toonden een maximale OCR van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm. Terwijl sel-12 mutanten OCR van ongeveer 10 picomoles per minuut hadden, per worm.

Gebruik levende, goed gevoede en asynchroniseerde dieren in deze test, en vermijd de overdracht van eieren of karkassen in assay putten. Bovendien mag de interne temperatuur van het instrument niet hoger zijn dan 25 graden Celsius. Bleekmiddel, FCCP, FUdR en natriumadium zijn giftig.

Daarom moet ervoor worden gezorgd dat beschermende handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding van voorraadoplossingen en het laden van drugs.