Måling af ilt forbrug satser i intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondriel funktion er afgørende for cellulære homøostase og iltforbrug sats er en afgørende indikator for mitokondrielle sundhed. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til analyse af iltforbrug i C.elegans. Denne protokol gør brug af levende, mobile C.elegans giver en juridisk måling af mitokondrielle funktion.

Opløftende behovet for at isolere mitokondrier, et skridt, der potentielt kan påvirke det integritet. Til at begynde, overføre L4 larver af ønskede genetiske baggrunde på en friskfrøet græsplæne af Escherichia coli på nematode vækstmedier eller NGM plader. Brug mindst to 100 mm eller tre 60 mm plader til hver stamme.

Inkuber ormene ved den rette væksttemperatur i tre til fire dage, eller indtil pladerne er koncentreret med et stort antal æg og gravid orme. Vask æg og orme af pladerne med ca. 6 milliliter M9-buffer pr. 100 millimeter plade af nematoder. Brug glas græs pipetter, overføre æg og orme i individuelle 15 milliliter centrifuge rør for hver stamme.

Drej disse rør ned i tre minutter ved 6, 180 g. Efter centrifugering, aspirere ud M9 buffer bevarer netop dyr og æg pellet. Tilføj tre til fire milliliter blegemiddel opløsning til hvert rør og intermitterende vortex i seks minutter.

Derefter tilsættes M9 buffer til at fylde hvert rør og spin på 6, 180 g i et minut. Inspirer supernatanten og gentag denne vask med M9, tre gange. Efter vask, flyttes ægpellet til en frisk 15 milliliter rør, der indeholder ca. ni milliliter M9 buffer.

Synkroniser de nyudklækkede orme ved at duppe ved 20 grader Celsius i 16 til 48 timer. Efter spinding disse rør ned på 6, 180 g i 1,5 minutter, sætte synkroniserede L-1 dyr ned på en frisk seedet græsplæne af OP50 på de enkelte NGM plader. Hold pladerne ved 20 grader Celsius, indtil dyrene når L-4 larve fase efter ca 42 timer.

På dette tidspunkt, bruge en platin pick til at flytte L4 larver til OP50 seedede NGM plader, der indeholder 0,5 milligram pr. milliliter FUdR for at forhindre, at der produceres afkom. Hydrer sensorpatronen ved at tilsætte 200 mikroliter destilleret vand til hver brønd på pladen, så sensorsonderne er nedsænket. Opbevar pladerne natten over ved stuetemperatur.

Sluk for varmeelementet i respirometergrænsefladen. Opbevaring af maskinen inde i en 15 grader Celsius inkubator sænker kernetemperaturen i maskinen og forhindrer dyrene i at overophede under analysen. Efter nattens inkubation pipettes det destilleret vand, der bruges til at fugte sensorsonderne, ud og udskifte det med 200 mikroliter af kalibreringsopløsningen i hver brønd.

FCCP-stamopløsningen fortyndes til 100 mikromolar FCCP i destilleret vand. Tilsæt derefter 20 mikroliter af den fortyndede opløsning til injektionsport A i sensorpatronen. Der tilsættes 22 mikroliter på 400 millimolarnatriumazider til sensorpatronens injektionsport B.

Tænd for respirometeret. Vælg start på startskærmen, og skabelonsiderne vises. Vælg tom” eller en skabelon, der er designet tidligere på skabelonsiden.

Gruppesiden vises. På gruppesiden skal du vælge brønde A og H som baggrundstinge og tildele de resterende seks brønde i passende grupper i henhold til forsøgsplanen. Få adgang til protokolsiden ved at klikke på pilen nederst til højre, og sørg for, at ligevægten, basal og injektioner en og to-knappen er valgt.

Juster antallet af aflæsninger af basal OCR samt maksimal OCR og ikke-mitokondriel OCR. Vælg pilen i nederste højre hjørne. Der vises en meddelelse om at indlæse sensorpatronpladen.

Sørg for, at sensorpatronens plade er placeret i den rigtige retning, ved at følge vejledningen på påmindelsesmeddelelsesskærmen. Respirameteret vil nu ligevægte patronen. Der tilsættes 200 mikroliter M9-buffer i hver af de otte brønde og de omkringliggende reservoirer på cellepladen.

Pick ca 100 orme fra hver stamme på unseeded NGM plader, og lad det hvile i to til tre minutter. Derefter våd slutningen af platin pick med M9 buffer og pick 20 alder synkroniseret dyr i brønde B gennem G, forlader baggrunden brønde A og H tom. Klik nu på OK på respirometersoftwaren for at skubbe pladen, der indeholder kalibreringsbufferen ud.

Fjern pladen fra respirometeret og lade sensorpatronen være inde i instrumentet. Sæt kalibrantpladen på med den plade, der indeholder dyrene. Læg plader og lukke døren ved at trykke fortsætte og lad analysen til at køre.

Når analysen er fuldført, skal du følge anvisningerne på skærmen for at fjerne cellepladen og sensorpatronen. Indsæt et flashdrev i USB-porten for at gemme køredatakrigsformatet. Fjern sensorpatronen, og lad dyrene falde til bunds i bunden af brøndene i ca. to minutter.

Placer cellepladerne under et stereodekermikroskop, og tæl antallet af dyr pr. brønd. Åbn analysesoftwaren, efterfulgt af fanen normalisering, for at normalisere iltforbruget til antallet af dyr. Anvend passende niveauer for de forskellige grupper under fanen rediger, og eksportér filen som en prismefil til yderligere analyse.

Gennemsnittet af de første fem målinger er den basale OCR. Gennemsnittet af de fem målinger efter FCCP-tilføjelse er den maksimale OCR. Endelig er gennemsnittet af de sidste fem målinger efter natriumazidid-tilsætning den ikke-mitokondrielle respirationshastighed.

Da calciumdysregulering kan resultere i ændret mitokondriel funktion, blev OCR hos både sel-12 mutanter og vilde dyr målt for at undersøge virkningen af sel-12 mutationer på mitokondriel funktion og sundhed. Vilde type dyr konsekvent viste basal OCR satser under fem picomoles per minut, per orm. Mens alle tre stammer af sel-12 mutanter viste signifikant forhøjet OCR, på cirka syv picomoler per minut, per orm.

Ved tilsætning af FCCP, der var en stigning i OCR af vilde type, samt sel-12 mutanter, som forventet. Vilde type dyr viste maksimal OCR på cirka syv picomoler per minut, per orm. Mens sel-12 mutanter havde OCR på ca. 10 picomoler pr. minut, pr. orm.

Brug levende, godt fodret, og asynkroniserede dyr i denne analyse, og undgå overførsel af æg eller slagtekroppe i assay brønde. Desuden bør instrumentets indre temperatur ikke overstige 25 grader Celsius. Bleach, FCCP, FUdR, og natrium azide er giftige.

Derfor bør man passe på med beskyttelseshandsker under klargøring af lageropløsninger og lægemiddelbelastning.