अक्षुण्ण केनोहाब्दितिस एलीगेंस में ऑक्सीजन उपभोग दरों का मापन

माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन सेलुलर होयोस्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण है और ऑक्सीजन की खपत दर माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का एक निर्णायक संकेतक है। यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस में ऑक्सीजन खपत दर का विश्लेषण करने की दिशा में विस्तृत निर्देश प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल लाइव, मोबाइल सी. एलिगेंस का उपयोग करता है जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का कानूनी माप प्रदान करता है।

माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने की आवश्यकता को बढ़ाते हुए, एक ऐसा कदम जो संभवतः यह अखंडता को प्रभावित कर सकता है। शुरू करने के लिए, नेमाटोड ग्रोथ मीडिया या एनजीएम प्लेटों पर एस्चेरिचिया कोलाई के एक हौसले से वरीयता प्राप्त लॉन पर वांछित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के एल 4 लार्वा को स्थानांतरित करें। प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम दो 100 मिमी या तीन 60 मिमी प्लेटों का उपयोग करें।

तीन से चार दिनों के लिए उचित विकास के तापमान पर कीड़े को इनक्यूबेट करें, या जब तक प्लेटें बड़ी संख्या में अंडे और ग्रेविड कीड़े के साथ केंद्रित न हों। नेमाटोड की प्रति 100 मिलीमीटर प्लेट में लगभग 6 मिलीलीटर M9 बफर का उपयोग करके प्लेटों से अंडे और कीड़े धोएं। कांच के चारागाह पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक तनाव के लिए अंडे और कीड़े को व्यक्तिगत 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।

6, 180 ग्राम पर तीन मिनट के लिए नीचे कर रही है ट्यूब स्पिन। अपकेंद्रित्र के बाद, सिर्फ जानवर और अंडे की गोली को बनाए रखने M9 बफर बाहर aspirate । प्रत्येक ट्यूब में तीन से चार मिलीलीटर ब्लीच समाधान जोड़ें और छह मिनट के लिए रुक-रुक कर भंवर डालें।

फिर, प्रत्येक ट्यूब को भरने के लिए M9 बफर जोड़ें और एक मिनट के लिए 6, 180 ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और इस वॉश को M9 के साथ दोहराएं, तीन बार। धोने के बाद, अंडे की गोली को एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब पर ले जाएं जिसमें लगभग नौ मिलीलीटर M9 बफर होते हैं।

16 से 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नटखट करके हौसले से रची कीड़े सिंक्रोनाइज़ करें। इन ट्यूबों को 1.5 मिनट के लिए 6, 180 ग्राम पर नीचे कताई करने के बाद, सिंक्रोनाइज्ड एल-1 जानवरों को व्यक्तिगत एनजीएम प्लेटों पर OP50 के एक हौसले से वरीयता प्राप्त लॉन पर नीचे रखें। प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक रखें जब तक कि जानवर लगभग 42 घंटे के बाद एल-4 लार्वा चरण तक न पहुंच जाए।

इस समय, एक प्लेटिनम लेने का उपयोग करने के लिए OP50 वरीयता प्राप्त NGM FUdR के मिलीलीटर प्रति ०.५ मिलीग्राम युक्त प्लेटों के लिए L4 लार्वा ले जाने के लिए संतान उत्पादन से रोकने के लिए । प्लेट पर प्रत्येक कुएं में आसुत पानी के 200 माइक्रोलीटर जोड़कर सेंसर कारतूस को हाइड्रेट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सेंसर जांच जलमग्न हो। कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटों को स्टोर करें।

श्वसन इंटरफेस के भीतर हीटिंग तत्व बंद कर दें। मशीन को 15 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर स्टोर करने से मशीन के भीतर कोर तापमान कम हो जाता है और परख के दौरान जानवरों को ओवरहीटिंग से रोकता है । रात भर इनक्यूबेशन के बाद, सेंसर जांच को हाइड्रेट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आसुत पानी को बाहर निकालें और त्यागें, और इसे प्रत्येक कुएं में कैलिब्रेंट समाधान के 200 माइक्रोलीटर के साथ बदल दें।

आसुत पानी में 100 माइक्रोमोलर एफसीसीपी के लिए एफसीसीपी स्टॉक समाधान को पतला करें। फिर, सेंसर कारतूस में इंजेक्शन पोर्ट ए के लिए पतला समाधान के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेंसर कारतूस के इंजेक्शन पोर्ट बी में 400 मिलीमोलर सोडियम एजाइड्स के 22 माइक्रोलीटर जोड़ें।

अब श्वसनमीटर चालू करें। होम स्क्रीन पर, स्टार्ट चुनें और टेम्पलेट पेज दिखाई देंगे। टेम्पलेट्स पेज पर, खाली चुनें “या पहले से डिज़ाइन किया गया टेम्पलेट।

समूह पृष्ठ दिखाई देगा। समूह पृष्ठ पर, पृष्ठभूमि कुओं के रूप में कुओं ए और एच का चयन करें, और प्रायोगिक योजना के अनुसार उचित समूहों में शेष छह कुओं आवंटित । निचले दाईं ओर तीर पर क्लिक करके प्रोटोकॉल पृष्ठ तक पहुंचें, और यह सुनिश्चित करें कि समतुल्य, बेसल और इंजेक्शन एक और दो बटन का चयन किया जाए।

बेसल ओसीआर के साथ-साथ अधिकतम ओसीआर और नॉन-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर की रीडिंग की संख्या को समायोजित करें। निचले दाहिने कोने पर तीर का चयन करें। सेंसर कारतूस प्लेट लोड करने के लिए एक संकेत दिखाई देगा।

सुनिश्चित करें कि रिमाइंडर प्रॉम्प्ट स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए सेंसर कारतूस प्लेट को सही ओरिएंटेशन में लोड किया गया है। रेसीडेंपिटर अब कारतूस को बराबर कर देगा। सेल प्लेट के आठ कुओं और आसपास के जलाशयों में से प्रत्येक में M9 बफर के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें ।

गैर वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेटों पर प्रत्येक तनाव से लगभग 100 कीड़े चुनें, और दो से तीन मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें। फिर, M9 बफर के साथ प्लेटिनम लेने के अंत गीला और जी के माध्यम से कुओं बी में 20 उंर सिंक्रोनाइज्ड जानवरों उठाओ, पृष्ठभूमि कुओं ए और एच खाली छोड़ । अब, कैलिब्रेशन बफर युक्त प्लेट को बाहर निकालने के लिए श्वसन सॉफ्टवेयर पर ओके पर क्लिक करें।

यंत्र के अंदर सेंसर कारतूस छोड़ने श्वसन से प्लेट निकालें। कैलिब्रेंट प्लेट को जानवरों वाली प्लेट से बदलें। प्लेटें लोड करें और दरवाजा बंद करें और परख को चलाने की अनुमति दें।

एक बार परख चलाने के पूरा हो गया है, सेल प्लेट और सेंसर कारतूस को हटाने के लिए स्क्रीन पर संकेतों का पालन करें । रन डेटा युद्ध प्रारूप को बचाने के लिए यूएसबी पोर्ट में एक फ्लैश ड्राइव डालें। सेंसर कारतूस निकालें और जानवरों को लगभग दो मिनट के लिए कुओं के नीचे बसने की अनुमति दें।

कोशिका प्लेटों को एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और प्रति अच्छी तरह से जानवरों की संख्या गिनें। विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें, सामान्यीकरण टैब के बाद, पशु संख्या के लिए ऑक्सीजन की खपत दरों को सामान्य करने के लिए। संशोधित “टैब के तहत विभिन्न समूहों के लिए उचित स्तर लागू करें, और आगे के विश्लेषण के लिए एक चश्मे फ़ाइल के रूप में फ़ाइल का निर्यात करें।

पहले पांच मापों का औसत बेसल ओसीआर है। एफसीसीपी इसके अलावा के बाद पांच मापों का औसत अधिकतम ओसीआर है। अंत में, सोडियम एजाइड इसके अलावा के बाद पिछले पांच मापों का औसत गैर-माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर है।

चूंकि कैल्शियम डिस्रेगुलेशन के परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन बदल सकता है, इसलिए सेल-12 म्यूटेंट और जंगली प्रकार के जानवरों दोनों में ओसीआर को माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और स्वास्थ्य पर सेल-12 म्यूटेशन के प्रभाव की जांच करने के लिए मापा गया था। जंगली प्रकार के जानवरों ने लगातार प्रति मिनट पांच पिकोमोल्स से नीचे बेसल ओसीआर दरों को दिखाया, प्रति कीड़ा। जबकि सेल-12 म्यूटेंट के सभी तीन उपभेदों ने प्रति कीड़ा प्रति मिनट लगभग सात पिकोमोल्स के ओसीआर को काफी ऊंचा दिखाया।

एफसीसीपी के अलावा, जंगली प्रकार के ओसीआर में वृद्धि हुई, साथ ही सेल-12 म्यूटेंट, जैसा कि उम्मीद थी। जंगली प्रकार के जानवरों ने प्रति कीड़ा प्रति मिनट लगभग सात पिकोमोल्स की अधिकतम ओसीआर दिखाई। जबकि सेल-12 म्यूटेंट में प्रति कीड़ा प्रति मिनट लगभग 10 पिकोमोल्स का ओसीआर था।

इस परख में जीवित, अच्छी तरह से खिलाया, और अतुलनीय जानवरों का उपयोग करें, और परख कुओं में अंडे या शवों के हस्तांतरण से बचें। इसके अलावा, उपकरण का आंतरिक तापमान 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए। ब्लीच, एफसीसीपी, फ्यूडीआर, और सोडियम एजाइड विषाक्त हैं।

इसलिए, स्टॉक समाधान और दवा लोडिंग की तैयारी के दौरान सुरक्षात्मक दस्ताने पहनने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।