Måling av oksygen inntak priser på intakt Caenorhabditis elegans

Mitokondriefunksjon er avgjørende for cellulær homeostase og oksygenforbruk er en avgjørende indikator på mitokondriehelse. Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for å analysere oksygenforbruket i C.elegans. Denne protokollen gjør bruk av live, mobile C.elegans gir en juridisk måling av mitokondriefunksjon.

Heve behovet for å isolere mitokondrier, et skritt som potensielt kan påvirke det er integritet. Til å begynne, overføre L4 larver av ønsket genetisk bakgrunn på en nyseedd plen av Escherichia coli på nematode vekstmedier eller NGM plater. Bruk minst to 100 mm eller tre 60 mm plater for hver belastning.

Inkuber ormene ved riktig veksttemperatur i tre til fire dager, eller til platene er konsentrert med et stort antall egg og gravid ormer. Vask eggene og ormene av platene ved hjelp av ca. 6 milliliter M9-buffer per 100 millimeter plate nematoder. Bruk glassbeitepipetter, overfør egg og ormer til individuelle 15 milliliter sentrifugerør for hver stamme.

Spinn teter ned rørene i tre minutter ved 6, 180 g. Etter sentrifugering, aspirere ut M9 buffer beholde bare dyret og egg pellet. Tilsett tre til fire milliliter blekemiddelløsning til hvert rør og midlertidig virvel i seks minutter.

Deretter legger du til M9-buffer for å fylle hvert rør og spinne på 6, 180 g i ett minutt. Aspirer overnatanten og gjenta denne vasken med M9, tre ganger. Etter vasken flytter du eggpelleten til et friskt 15 milliliter rør som inneholder omtrent ni milliliter M9-buffer.

Synkroniser de nyklekkede ormene ved å nutating på 20 grader Celsius i 16 til 48 timer. Etter å ha snurret disse rørene ned på 6, 180 g i 1,5 minutter, legg de synkroniserte L-1 dyrene ned på en nyseeded plen av OP50 på individuelle NGM-plater. Hold platene på 20 grader Celsius til dyrene når L-4 larvalstadiet etter ca. 42 timer.

På dette tidspunktet, bruk en platina plukke for å flytte L4 larver til OP50 seeded NGM plater som inneholder 0,5 milligram per milliliter FUdR for å hindre fra å produsere avkom. Hydrer sensorkassetten ved å tilsette 200 mikroliter destillert vann til hver brønn på platen, slik at sensorprobene er nedsenket. Oppbevar platene over natten ved romtemperatur.

Slå av varmeelementet i respirometergrensesnittet. Lagring av maskinen inne i en 15 graders Celsius inkubator senker kjernetemperaturen i maskinen og hindrer dyrene i å overopphetes under analysen. Etter inkubasjon over natten, pipette ut og kast destillert vann som brukes til å hydrere sensorprober, og erstatte den med 200 mikroliter av kalifarløsningen i hver brønn.

Fortynn FCCP-lagerløsningen til 100 mikromos FCCP i destillert vann. Tilsett deretter 20 mikroliter av den fortynnede oppløsningen til injeksjonsport A i sensorkassetten. Tilsett 22 mikroliter med 400 millimolarnatriumazider til injeksjonsport B på sensorkassetten.

Slå på respirometeret. Velg start på startskjermen, og malsidene vises. Velg tom”eller en tidligere utformet mal på malsiden.

Grupper-siden vises. På gruppesiden velger du brønner A og H som bakgrunnsbrønner, og tilordner de resterende seks brønnene til passende grupper i henhold til den eksperimentelle planen. Få tilgang til protokollsiden ved å klikke pilen nederst til høyre, og sørg for at likevekt, basal og injeksjoner en og to knapp er valgt.

Juster antall avlesninger av basal OCR samt maksimal OCR og ikke-mitokondrie OCR. Velg pilen nederst til høyre. En melding om å laste sensorkassettplaten vises.

Kontroller at sensorkassettplaten er lagt i riktig retning, og følg instruksjonene på skjermbildet for påminnelsesmelding. Respirameteret vil nå likevekte sylinderampullen. Tilsett 200 mikroliter M9-buffer i hver av de åtte brønnene og de omkringliggende reservoarene på celleplaten.

Plukk ca 100 ormer fra hver belastning på usette NGM plater, og la det hvile i to til tre minutter. Deretter luke slutten av platina plukke med M9 buffer og plukke 20 alder synkronisert dyr i brønner B til G, forlater bakgrunnen brønnene A og H tom. Klikk nå OK på respirometerprogramvaren for å løse ut platen som inneholder kalibreringsbufferen.

Fjern platen fra respirometeret og la sensorkassetten være inne i instrumentet. Sett på kalibrantplaten med platen som inneholder dyrene. Last plater og lukk døren ved å trykke fortsett og la analysen kjøre.

Når analysen er fullført, følger du instruksjonene på skjermen for å fjerne celleplaten og sensorkassetten. Sett inn en flash-enhet i USB-porten for å lagre kjøredatakrigsformatet. Fjern sensorkassetten og la dyrene legge seg til bunnen av brønnene i ca. to minutter.

Plasser celleplatene under et stereodeksjonsmikroskop og telle antall dyr per brønn. Åpne analyseprogramvaren, etterfulgt av normaliseringsfanen, for å normalisere oksygenforbruket til dyrenummer. Bruk passende nivåer for de ulike gruppene under endre”-kategorien, og eksporter filen som en prismefil for videre analyse.

Gjennomsnittet av de fem første målingene er basal OCR. Gjennomsnittet av de fem målingene etter FCCP-tillegg er den maksimale OCR. Til slutt er gjennomsnittet av de siste fem målingene etter natriumazididtillegg ikke-mitokondriekondrasjonshastigheten.

Siden kalsiumdysregulering kan føre til endret mitokondriefunksjon, ble OCR hos både sel-12 mutanter og ville dyr målt for å undersøke effekten av sel-12 mutasjoner på mitokondriefunksjon og helse. Ville typer dyr viste konsekvent basal OCR priser under fem picomoles per minutt, per orm. Mens alle tre stammer av sel-12 mutanter viste betydelig forhøyet OCR, på omtrent syv picomoles per minutt, per orm.

Ved tillegg av FCCP var det en økning i OCR av vill type, samt sel-12 mutanter, som forventet. Ville typer dyr viste maksimal OCR på omtrent syv picomoler per minutt, per orm. Mens sel-12 mutanter hadde OCR på ca 10 picomoles per minutt, per orm.

Bruk levende, godt matet og asynkroniserte dyr i denne analysen, og unngå overføring av egg eller skrotter til analysebrønner. Videre bør den indre temperaturen på instrumentet ikke overstige 25 grader Celsius. Blekemiddel, FCCP, FUdR og natriumazid er giftige.

Derfor bør det tas hensyn til å bruke vernehansker under fremstilling av lagerløsninger og legemiddelbelastning.