Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
In vivo direkt omprogrammering av bosatta gliaceller i interneuroner genom intracerebral injektion av virala vektorer
Chapters
Summary June 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll syftar till att generera direkt omprogrammeras interneuroner in vivo, med hjälp av en AAV-baserade virus system i hjärnan och en FLEX synapsin-driven GFP reporter, som möjliggör cell identifiering och ytterligare analys in vivo.
Transcript
Detta protokoll visar att det är möjligt att generera nya nervceller direkt i hjärnan från bosatta glia och att dessa omprogrammerade celler mogna till subtyp-specifika nervceller. Den största fördelen är det cre-beroende AAV-virus som möjliggör specifik inriktning av NG2-glia och GFP-reportern som etiketterar de omprogrammerade nervcellerna för analys. Generera nya nervceller i hjärnan kan leda till framtida utveckling för cellersättning terapier i hjärnan.
I vårt protokoll genererar vi de parvalbumin-positiva interneurons som har konsekvenser för psykiatriska störningar. In vivo omprogrammering kan tillämpas på andra områden hjärnan och kretsar beroende på vad neuronal fenotyp och neurologiska tillstånd du vill rikta. Demonstrerar proceduren blir Jenny Johansson:a tekniker, Maria Pereira:a tidigare doktorand, och Marcella Birtele:a phd student i vårt lab.
För att producera AAV5 viral vektor, utsäde HEK293T celler med standard odlingsmedium i fem T175 kolvar. När cellerna når 50 till 70%konfluency, förbereda följande mix för transvection. I en 50 milliliter centrifuge rör, lägga till lika molar mängder av vektor plasmid, och pDG-serien helper plasmid.
Lägg tris-EDTA buffert till en slutlig volym av 144 mikroliter sedan lägga till ultrapure vatten för att resultera i en total volym av 1296 mikroliter och blanda. Därefter lägger du till 144 mikroliter av 2,5 molar kalciumklorid och blanda. Därefter lägger du till 1,92 milliliter HBS till DNA-lösningen och virvelen omedelbart.
Inkubera i rumstemperatur i exakt 60 sekunder. Därefter överför lösningen till 28 milliliter av färskt cellodlingsmedium och blanda. Byt ut mediet i kolvarna mot det medium som innehåller transvection mix.
Vänta i tre dagar, och överför media till avfall. Tillsätt fem milliliter skördebuffert till varje kolv, tillsätt sedan ytterligare fyra milliliter DPBS till varje kolv för att skölja de återstående cellerna och pool med celllösningen. Centrifugera de skördade cellerna vid 1, 000 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius.
Efter centrifugeringen, avlägsna supernatanten och lös upp pelleten i 15 milliliter lysbuffert. Frys 50 milliliter centrifugeröret på torris i 15 minuter och förvara i en minus 20 grader Celsius frys. Före användning tina den skördade cellen lysate i ett vattenbad vid 37 grader Celsius.
I detta förfarande, utför AAV rening genom iodixanol gradient ultracentrifugation och använda ultracentrifug takrör med centrifugering vid 350, 000 x g i en timme och 45 minuter vid rumstemperatur. För att extrahera AAV-innehållande fas, sätt in en 10 milliliter spruta med en 18 gauge nål på cirka två millimeter under 40 till 60%fas gränsen med avfasningen uppåt och dra tillbaka. Se till att sluta innan du når proteinbandet efter fem till sex milliliter av viral vektor har extraherats.
Sedan, rena och koncentrera den utspädda iodixanol gradienten genom en anjon utbyte filter, genom att driva igenom den i en takt inte snabbare än en droppe per sekund. Därefter trycker du tre milliliter IE-buffert långsamt genom filtret för att tvätta det. Därefter elute blandningen i en centrifugalfilterenhet med en till två milliliter elueringsbuffert.
Lägg till DPBS till enheten till en slutlig volym på fyra milliliter. Centrifugera vid 2, 000 x g vid rumstemperatur tills mindre än 0,5 milliliter DPBS lämnas kvar i filtret. Efteråt, ta bort vätska från botten av röret, fylla på med fyra milliliter DPBS, och centrifug igen.
Upprepa detta steg ytterligare två gånger, se till att volymen koncentrerad vektor på filtret är ca 200 mikroliter efter den sista centrifugeringen. Ta bort den 200 mikroliter koncentrerade vektorn med hjälp av en pipetten, och tryck igenom en 0,22 mikrometer filter för att sterilisera. Därefter alikvot 200 mikroliter i en glasflaska med förreglade insats.
För att injicera omprogrammeringsfaktorer placerar du en sövd mus i stereotaxic-ramen. Administrera lämpliga analgesi i början av operationen, sedan ta med spetsen av glas kapillären av injektionsnålen strax ovanför bregma. Se till att kapillärspetsen är helt rak i både A-P- och M-L-plan.
Återställ både M-L- och A-P-värdena till 0,0 på den digitala koordinaträknaren. För att se till att djurets huvud är i ett helt plant läge, använd den digitala koordinaträknaren för att mäta D-V-koordinatvärdet när A-P-armen är på plus 2,0 och minus 2,0 samt när M-L-armen är på plus 2,0 och minus 2,0. Justera höjden på tandstången och öronstängerna i enlighet med detta.
Efteråt, höj sprutan något och borra ett hål med hjälp av en tandborr vid injektionskoordinaterna. Börja borra på platsen, arbeta i en cirkulär och skonsam sätt. Placera sedan en bit bomullsgasväv över det öppna snittet och spola sprutan med saltlösning.
Efter spolning, rita upp en luftbubbla och sedan en mikroliter lösning som innehåller viral vektor. Se till att viral lösning lätt kan visualiseras under luftbubblan. Därefter sänk sprutan, fortskrider långsamt till önskat djup, och var säker på att banan är fri från benfragment.
Därefter injicera en mikroliter av viruslösningen med en hastighet av 0,4 mikroliter per minut. När injektionen är klar, låt två minuter för diffusion före spruttillbakadragande. Efter diffusion, dra långsamt tillbaka sprutan tills toppen av kapillären är helt tillbaka från hjärnan, suturera sedan försiktigt snittet och ta bort djuret från den stereotaxiska ramen.
Övervaka djuret i en postoperativ station tills medvetandet återfås. Djur hålls i upp till 12 veckor efter virusinjicering för att tillåta bosatta glia att programmera om till mogna nervceller. För att förbereda hjärnan skivor för elektrofysiologi med hjälp av en vibratom, dela upp hjärnan från den mest rostrala delen ner till striatal nivå vid hög hastighet.
Dela sedan upp striatumkoronally vid 275 mikrometer på 0,1 millimeter per sekund. Efter varje avsnitt, ta försiktigt bort den icke-injicerade striatalsidan och överför den injicerade sidan i en injektionsflaska med ett bottennät och syresatt CREB-avkänningsrutschkana i vattenbadet vid rumstemperatur. Håll injektionsflaskan i rumstemperatur tills alla sektioner är avskurna.
Efteråt, långsamt öka temperaturen i vattenbadet till 37 grader Celsius och lämna den i 30 minuter, stäng sedan av värmaren och låt den svalna till rumstemperatur. Efter att ha överfört en vävnadssektion till en inspelningskammare för elektrofysiologi, montera glaspipetten på inspelningselektroden och sänk ner den i lösningen. Dubbelkolla elektrodens motstånd.
Sedan, långsamt närma sig omprogrammerad cell med pipetten, hålla ett lätt positivt tryck i elektroden för att undvika att plugga spetsen, och kontrollera att cellen är GFP positiv innan lappning. När cellen är lappad, behålla cellen i strömklämma från minus 60 till minus 70 millivolt, och injicera 500 millisekunders strömmar från minus 20 till plus 90 picoamperes med 10 picoampere-steg för att framkalla handlingspotentialer. Detta är ett tecken på en neuronal mognad och framgångsrik omprogrammering.
Därefter, växla till spänning klämma och mäta inåt natrium och fördröjd rättning av kaliumströmmar vid depolariserande steg på 10 millivolt. Här är ett inlägg inspelade biocytin fyllda omprogrammerade neuron som visar mogna neuronal morfologi och dendritiska ryggar. Här visar elektrofysiologiska inspelningar av de omprogrammerade nervcellerna förekomsten av postynaptic funktionella anslutningar med spontana aktivitetsåtgärder.
Spår visar den hämmande aktivitet som är blockerad med pikrotoxin, en GABAA-receptorantagonist och den excitatoriska aktivitet som är blockerad med CNQX, en AMPA-receptorantagonist. Den lappade nervceller visar redan postynaptic aktivitet på fem veckor efter injektion, och fortsätta på åtta och 12 veckor efter injektion. Antalet nervceller med nuvarande inducerad åtgärder potentialer ökar också över tiden.
En mer detaljerad analys visade flera distinkta bränning mönster där majoriteten av celler visar snabb spiking verksamhet som liknar parvalbumin interneurons. Immunohistochemical analys på 12 veckor visade ytterligare co-uttryck av reportern GFP och parvalbumin. Efter denna procedur kan du undersöka genen uttryck med patch söka teknik eller bedöma de tredimensionella synaptic anslutning med monosynaptic spårning och iDISCO.
Nu när det är möjligt att programmera om resident glia till parvalbumin som uttrycker interneurons, har vi börjat undersöka om dessa är autentiska och kan användas som ett terapeutiskt verktyg. Kom ihåg att följa de fastställda protokollen och riktlinjerna vid hantering av djur och användning av AAV-virus.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
