In vivo intracerebral Stereotaxic injektioner för Optogenetisk stimulering av långväga ingångar i mushjärna skivor

Syftet med denna metod är att identifiera den funktionella anslutningen av långväga ingångar från avlägsna hjärnregioner med hjälp av photostiulation i hjärnskivor. Den stereotaxic inriktningen av en specifik hjärna region för olika medierad uttryck av ljuskänsliga jonkanaler möjliggör selektiv stimulering av axoner som kommer från den regionen med ljus. Demonstrera förfarandet kommer att Louis Richevaux, en doktorand från min grupp.

Innan operationen, kontrollera att djuret är väl sövd med en tå nypa. Dra försiktigt ut tungan för att underlätta andningen. Sedan rakar kranialhåret.

Injicera 20 mikroliter lidokainhydroklorid under huden på huvudet för lokalbedövning och vänta fem minuter. För att exponera skallen, gör ett snitt i hårbotten. Placera sedan djuret i en stereotaxisk ram.

Sätt i öronstängerna och vila dem på benen något rostral till öronen och dra ner huden för att skapa god tillgång till skallen. Dra åt öronstängerna och installera nosstycket. Underhåll djurets kropp horisontellt och på huvudets nivå med hjälp av ett höjdjusterat stöd.

Placera en värmedyna under djuret för att hålla den vid fysiologisk temperatur. Rengör sedan skallen genom att applicera 0,9%natriumklorid med en bomullspinne för att avlägsna mjukvävnad. Justera skallen så att bregma lambda åtkomsten är utjämnad.

Sedan, lokalisera injektionsstället på skallen enligt de bakre och mediala koordinaterna och placera injektionsnålen ovanför den. Märk skallen med en engångsnål. Därefter flytta injektionsnålen uppåt med fyra centimeter.

Med hjälp av en 0,5 millimeters burr, skapa en en millimeter diameter craniotomy på märket vid ena halvan av den maximala hastigheten. Svabb med en vävnad om någon blödning uppstår. Därefter tömma vattnet som finns i Hamilton sprutan för lagring genom att helt mata ut den med en pump.

Endast nålen är fylld med vatten. Tina den virala lösningen som ska injiceras på is, sedan, kort ta bort den från isen och få 700 nanoliter av lösningen med en mikropipette. Därefter sätter du in en droppe på en bit paraffinfilm.

Placera paraffinfilmen ovanpå kraniotomi. Kasta nålen i droppe viral lösning utan att ändra anteroposterior och lateral position. Efteråt, använd pumpens återträdande funktion för att fylla sprutan med ca 500 nanoliter av viruslösningen på paraffinfilmen.

Utför denna procedur under stereoscope, titta på droppe försvinner, och se till att inte aspirera någon luft. Kontrollera att sprutan har fyllts korrekt. Testa utkastsystemet genom att köra ner kolven för att testa mata ut en liten droppe vätska.

Därefter för in nålen i hjärnan till det valda djupet. Tryck på löpknappen för injektion. Sedan, långsamt dra tillbaka nålen under tre till fem minuter.

Tvätta omedelbart nålen i rent destillerat vatten genom att fylla tömning av den flera gånger för att undvika igensättning. Efteråt, ta bort djuret från stereotaxic ramen. Suture huden och göra tre eller fyra stygn bundna med 2-1-1 standard kirurgiska knutar.

För att extrahera hjärnan, gör ett snitt på huden från halsen till näsan, sedan sektionera de sista kotorna från skallen med sax. Dra tillbaka huden och skär skallen längs mittlinjen från caudal till rostral riktning. Ta försiktigt bort parietalbenet och den caudala delen av frontalbenet.

Extrahera hjärnan med en liten rundad spatel genom att infoga den mellan hjärnan och hjärnskålen golvet, dela upp luktbulben, synnerven, och andra kranialnerv och lillhjärnan. Försiktigt dränka hjärnan i iskallskärande lösning. Därefter överför hjärnan till ett filterpapper och torka försiktigt den kortikala ytan.

Limma hjärnbarken till provhållaren av en vibratom med caudalsidan mot bladet för att skära horisontella hjärnskivor. Fyll sedan skärkammaren med iskall syresatt skärlösning så att hjärnan är helt nedsänkt. Avsnitt 300 mikrometer tjocka skivor med vibratomen med en hastighet av 07 millimeter per sekund vid en millimeter amplitud.

I detta skede rekommenderas att kortfattat kontrollera Chronos-GFP-uttrycket i thalamus med hjälp av en fluorescerande ficklampa och motsvarande filterglas. För att utföra helcells patch-clamp inspelning, försiktigt överföra en hjärna skiva som innehåller hippocampus komplex till inspelningskammaren. Kontinuerligt granska inspelningen kammaren med 34 grader Celsius ACSF bubblade med karbiogen på två till tre milliliter per minut.

Kort undersöka Chronos-GFP uttryck i axon terminaler i regionen av intresse med blå LED belysning vid 4X förstoring. Ändra till en 63X nedsänkning mål och justera fokus. Kontrollera om axoner uttrycker Chronos-GFP och välj en pyramidal neuron för patchinspelning.

Därefter fyller du en pipett med kaliumglukonat baserad intern lösning. Montera den i pipetthållaren på huvudscenen. Lappa cellen i spänningsklämma konfiguration.

Närma dig den identifierade neuronen och tryck försiktigt pipettspetsen på soma. Det positiva trycket bör producera en grop på membranytan. Släpp sedan trycket för att skapa en gigoOm-tätning.

När den har förseglats, ställ in hållspänningen på minus 65 millivolt. Bryt membranet med en skarp puls av undertryck. Spela in svaren från neuronen till hyperpolariserande och depolariserande nuvarande steg i hela cellen nuvarande klämma läge.

Spela in i ström eller spänning klämma postynaptic svar på 475 nanometer LED hela-fält stimulering av afferenta fibrer uttrycker Chronos. Stimulera med tåg om tio stimulering av två millisekunders varaktighet vid 20 hertz. Aktiviteten i presubicular nervceller i lager tre som svar på hyperpolarizing och depolarizing aktuella steg registrerades i hela-cellen patch-clamp konfiguration.

Stimulera ADN axon terminaler uttrycker Chronos-GFP framkallas excitatoriska post-synaptiska potentialer i presubicular lager tre huvudsakliga celler i nuvarande klämma läge. Beroende på ljusintensitet kunde EPSP:erna nå åtgärdspotentialtröskel. Post-synaptic svar observerades också i spänning klämma läge, som excitatoriska post-synaptic strömmar var framkallas.

Visas här är ett lager tre pyramidal neuron omgiven av thalamic axons uttrycker Chronos-GFP i presubicular ytliga lager med DAPI färgning avbildas med en epifluorescens mikroskop. Och den här bilden togs med en högre förstoring med ett konfokalmikroskop. Noggrann utjämning av bregma längs axeln i utför pilot experiment med en fluorescerande spårämne är avgörande för att förbättra precisionen i stereotaxic injektion.

Denna procedur kan också användas för att undersöka konvergerande projektioner från olika områden genom att injicera vid två generativa scen känsliga för två olika våglängder. Utvecklingen av denna teknik har möjlig gjort exakt anatomiska och funktionella krets analys mellan avlägsna hjärnan regioner i en cell typ specifikt sätt.