Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi
Chapters
Summary September 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode for bruk multiparameter Flow flowcytometri å oppdage mitokondrie reaktive oksygen arter (ROS) i murine sunn blodkreft stammen og stamceller (HSPCs) og leukemi celler fra en mus modell av akutt myelogen leukemi (AML) drevet av MLL-AF9.
Transcript
Reaktive oksygenarter eller ROS, er svært reaktive oksygenarter som produseres av celler, og påvirker deres oppførsel. Selv om overflødig ROS kan også forårsake utbredt cellulær kaos, og i alvorlige tilfeller, celledød. Dermed er vedlikehold av ROS homeostase av grunnleggende betydning for cellulær funksjon og overlevelse.
Protokollen presenteres her, fokuserer på å måle en bestemt type ROS, som genereres av mitokondrier, hovedsakelig som et metabolsk byprodukt i levende, normal eller sunn hematopoetisk stamme og stamcellepopulasjoner, samt i leukemiceller fra musemodellen av blodkreft, akutt myelogen leukemi eller AML. Denne protokollen kan også brukes til å evaluere hvordan genetisk manipulasjon, som gensletting eller overuttrykk, påvirker mitokondrieROS i flere sunne og ondartede hematopoetiske populasjoner. Og som et resultat, potensielt gi innsiktsfull informasjon om redux tilstand og muligens metabolismen av cellene.
Denne teknikken autoriserer flow settle metrisk analyse av en protogenic sonde for å overvåke mitokondrie ROS produksjon i levende sunn og ondartet hematopoetisk stamme og stamfar underpopulasjoner. Denne protokollen er enkel og kan fullføres om noen timer. Videre er det egnet for levende celleanalyse og gjør det mulig å skille og analysere mitokondrieROS i stamcellepopulasjonen i benmargen, ved hjelp av overflatemerke for farging.
Etter å ha samlet mononukleære benmargsceller fra ville trange mus og leukemiske MLL-AF9-mus, ifølge manuskriptet, aliquot 200 mikroliter av cellesuspensjonen i hver av ni enkeltfargekontrollrør. Aliquot de resterende cellene i andre eksperimentelle rør, 200 mikroliter hver. Deretter plasseres i en sentrifuge to eksperimentelle rør som inneholder benmargsceller og leukemiceller henholdsvis, og ett kontrollrør.
Sentrifuge ved 300 ganger G i fem minutter. Deretter dekanterer du overnatanten, og re-suspenderer cellene i romtemperatur F-PBS med en levende / død celleflekk, i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber på is i 30 minutter.
Etterpå legger du til 1 milliliter romtemperatur F-PBS til de tre levende / døde beisede rørene, og ett enkelt fargekontrollrør for mitokondrie ROS fargestofffarging. Plasser rørene i sentrifugen ved 300 ganger G i fem minutter ved romtemperatur. Deretter får du en 5 millimolar mitokondrie ROS fargestoff lager løsning ved å re-suspendere 50 mikrogram mitokondrie ROS fargestoff i 13 mikroliter dmso.
Tilsett deretter 13 milliliter romtemperatur F-PBS til 13 mikroliter mitokondrie ROS fargestoff for å fortynne til en endelig konsentrasjon på fem mikromos. Tilsett om nødvendig 13 mikroliter med 50 millimolar Verapamil til løsningen for å hemme mitokondriefflukspumper. Få rørene fra sentrifugen og aspirer av vasken av den levende / døde celleflekken.
Tilsett 200 mikroliter F-PBS i den levende / døde fargekontrollen og hold den i is til du er klar til å starte analysen. Tilsett 200 mikroliter av mitokondrie-ROS-fargestoffflekken som inneholder Verapamil, til hvert eksperimentelle rør, samt mitokondrie-ROS-fargekontrollrøret. Vortex å blande og inkubere i 10 minutter ved 37 grader Celsius i mørket.
Tilsett deretter 1 milliliter romtemperatur F-PBS til kontroll- og eksperimentelle rør. Sentrifuge fem minutter ved 300 ganger G ved romtemperatur. Aspirer av supernatent og vask cellene med en ekstra en milliliter romtemperatur F-PBS.
Sentrifuge igjen i fem minutter ved 300 ganger G, ved romtemperatur. Først forberede to antistoff cocktailer for sunne og leukemi benmargceller. Aspirer det overnaturante fra det eksperimentelle røret som inneholder sunne benmargsceller, og tilsett 200 mikroliter av antistoffcocktailen nummer én til røret.
Vortex å blande. Klargjør også enkeltfargekontrollrørene ved å legge til 200 mikroliter F-PBS og en mikroliter av det tilsvarende antistoffet. Inkuber i 60 minutter på is i mørket.
Aspirer det overnaturante fra det eksperimentelle røret som inneholder leukemibenmarg, og legg til 200 mikroliter av antistoffcocktail nummer to, til røret. Vortex å blande. Inkuber i 60 minutter på is i mørket.
Deretter vasker du alle rørene med 1 milliliter kald F-PBS og sentrifuge i fem minutter ved 300 ganger G ved romtemperatur. Re-suspendere cellene i 500 mikroliter av kalde F-PBS. Overfør cellefjæringen til hvert strømningscytometerrør med et 40 mikrometerfilter for å ekskludere aggregater.
Først setter du inn et ingen flekkkontrollrør inn i strømningscytometrimaskinen og starter oppkjøpet for å kompensere strømningscytometrimaskinen. Gjenta for andre kontrollrør. Etterpå kan du lese de eksperimentelle rørene for å sette opp portene.
For å analysere størrelsen og kompleksiteten til cellepopulasjonen, først for sunn HSPC, sett fremover scatter-området og side scatter området tomter populasjoner. Trykk på Square Gate-knappen, for å gate ut overflødig rusk fra forover og side scatter plot. Deretter, på en fremover scatter område og høyde tomten, bruke en dobbel diskriminerende å gate ut dobler.
Velg levende celler, avstamning lave celler, og de ulike sunne HSPC. For hver populasjon av interesse, analyser median fluorescensintensiteten til TRPE-kanalen i et histagramplott, for å evaluere forskjeller i mitokondrie-ROS-signalet. Gjenta samme prosedyre for størrelsesanalyse, gating og histogrammet plotting for leukemi populasjoner.
Benmargsceller isolert fra friske mus ble farget med et levende / dødt fargestoff og et mitokondrie ROS-fargestoff, og deretter farget med antistoffer som gjenkjenner avstamning markører:pluss CD48, C-kit, Sca-1, CD34 og CD150. I tillegg ble benmargsceller fra leukemimus også farget med CD45.2 for å diskriminere mellom MLL-AF9 leukemiceller fra friske mottakerbenmargsceller farget med CD45.1. En sammenligning av mitokondrie ROS farging, mellom sunn CD48 negativ LSK, og myeloid stamfar, viser at myeloid stamfar viser betydelig høyere nivåer av mitokondrie ROS farging.
Videre, c-Kit høy leukemi stamfar viser betydelig høyere nivåer av mitokondrie ROS farging, sammenlignet med c-Kit middels lav leukemi celler, sunn CD48 negative LSK og myeloid stamfar. C-Kit middels lav leukemi celler, viste også en betydelig høyere verdi sammenlignet med CD48 negative LSK celler, men ikke til myelogiske forfedre. Mitokondrie ROS fargestoffer er svært reaktive og passende vasketrinn er nødvendig for å sikre at eventuelle overskudd av fargestoffet er fjernet før du starter følgende trinn.
Det finnes flere kjemisk distinkte ROS fluorogene fargestoffer som kan brukes i denne protokollen, for å oppnå litt kunnskap om redux-statusen i levende hematopoetiske celler. Denne teknikken har blitt mye brukt i litteraturen, og kan gi nyttig innsikt om metabolske og signalveier som er differensialregulert i leukemiceller, sammenlignet med sine normale kolleger.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
