http://jovecomapi-svc-main-service/api/free/article/sv/59657

Renal subkapsulär transplantation av 2 '-Deoxyguanosinbehandlade murina embryonala bräss hos nakna möss

Thymus transplantation är en viktig metod för att undersöka bräss epitelial cell funktion och T-cellen mognad in vivo. Denna enkla och effektiva protokoll kan användas för att isolera och kultur mus 18,5 bräss för efterföljande transplantation i en njurmedicinska kapsel. Protokollet för 18.5-brässtransplantationen kan modifieras för thymic transplantation i andra utvecklingsstadier eller för andra vävnader av liknande storlek.

Dessutom är detta förfarande mycket enkelt. Detaljerna för några av de fall stämplar bör ses över noggrant när du utför denna teknik för första gången. Denna procedur innehåller detaljerade manipulationer som bättre kan illustreras med visualisering.

Efter uppoffring, torka den embryonala dagen 18,5 gravid mus med 70%etanol och använd autoklaverade steriliserade instrument för att göra ett v-format snitt på buken från blåsan upp till varje horn i livmodern. Använd sax för att skära mesometrium och livmoderhalscancer och vaginala områden och skörda livmodern i en petriskål som innehåller kall PBS på is. Skär den främre livmoderväggen från en livmoder horn till den andra för att exponera embryon inom omsluter till decidua och använda fin pincett att skala tillbaka de decidual vävnader.

Klipp navelsträngen för att släppa embryon för överföring till en ny Petriskål på is. För att skörda den första brässen torkar du ett embryo med 70% alkohol och överför embryot till en ny petriskål. Efter halshuggning, fixera embryot i skålen i ryggläge och använd steril sax för att skära den laterala bröstväggen horisontellt längs axillärfronten.

Skär membranet för att öppna bröstet. Brässen ska vara synlig som två vita lober som ligger framför luftstrupen och som gränsar till hjärtat. Sätt försiktigt in böjda spetstips bakom brässet och dra försiktigt upp för att skörda vävnaden.

Kontrollera thymusens integritet för att bekräfta att den innehåller två lederade lober. Tvätta sedan brässen med PBS innan du använder ett stereomikroskop för att trimma bort bindvävnaderna och blodkärlen. När alla av thymi har samlats in, överföra varje ren vävnad i enskilda brunnar av en 24 brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter av kultur medium per brunn.

Och tillsätt 2’deoxygranosin till en slutlig koncentration av 1,25 millimolar per brunn. Placera sedan den isolerade thymien i cellodlingsinkubatorn i åtta dagar. På den sista dagen av kultur, använd sax för att skära en hårbotten ven nål på infusionsröret delen i en 45 graders vinkel och bekräfta en brist på svar på tå nypa i en naken mottagare djur.

Placera musen på operationsbordet i en höger lateral position och använda en 0,5%povidone jod svabb till svabb huden i operationsområdet två gånger från insidan till utsidan av kroppen. Använd skalpell för att göra en fem till nio millimeter hud snitt parallellt med ryggraden i det vänstra njurområdet och skär genom subkutan vävnad och muskler för att öppna bukhålan. Med hjälp av ett par pincett med ena handen, lyft muskeln och fettvävnaden från ryggraden sidan snitt kanten av den exponerade njuren och använda den andra handen för att försiktigt pressa ut njuren.

För att hålla njurkapsel fuktig under operationen, blöta ytan av njuren med saltlösning och använda hårbotten nålen för att försiktigt repa njurkapseln på den nedre högra sidan om 1/2 till 2/3 bredden på njuren. Skjut infusionsröret i kapselns nick och försiktigt lossa njurkapseln från njuren lång långsidan av njuren ungefär tre till fyra millimeter i njurkapseln. Dra sedan tillbaka infusionsröret.

För att implantera brässet i det skapade delutrymmet, tvätta en kultur bräss två gånger i färsk saltlösning och anslut det klippta infusionsröret till en spruta. Aspirera långsamt den beredda brässen i det modifierade infusionsröret. Och sätt försiktigt in infusionsröret i njurkapseln tills den når den överlägsna polen.

För att leverera brässen i njurkapseln, dra tillbaka röret långsamt samtidigt som du samtidigt försiktigt trycker ned kolven. Med hjälp av en alkohollampa, lätt värma hårbotten nålen och efter att ha bekräftat att hela brässet är inne i subcapsular utrymmet, använd den uppvärmda nålen för att kauterisera nick. Återställ den kauteriserade njuren till bukhålan och stäng bukhinnan och muskeln med suturer.

Med hjälp av en modifierad avbruten vertikal madrass sutur, stäng huden snitt med minst tre knop och använda en povidone jod svabb för att desinficera snittet. Ge sedan en subkutan injektion av antibiotika och analgesi och placera musen under en infraröd lampa med övervakning tills full återhämtning. Här kan man observera en isolate embryonic day 18.5 bräss som innehåller två fullständiga lober.

Omedelbart efter implantation kan brässet visualiseras under njurkapseln vid mottagar njurens spets. Efter åtta veckors tillväxt inom det nakna musmottagarens djur förblir brässen under kapseln, men ökar kraftigt i storlek. T-celler produceras i både transplanterad bräss och perifert blod av naken mus mottagare.

Men som väntat, inga T-celler upptäcks i perifera av icke-transplanterade nakna djur. Vidare, i detta representativa experiment, upptäcktes ingen LacZ gen i de perifera T-celler som skördats från perifert blod av naken mus mottagare transplanteras med thymus lober som innehåller LacZ-allelen, vilket tyder på att perifera T-celler genererades från de mottagande djuren. Var försiktig när du skjuter in röret i en njurkapsel.

Undvik att bryta kapseln. Och se till att du har tillräckligt med utrymme i för bräss leverans. Thymic eller perifera T-cell populationer kan analyseras med hjälp av flödescytomet.

Var, immunsvar i mottagarens perifera vävnader kan analyseras av I2d och immun histochemical analys.