Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ניתוחים של פרוטאינוריה, חדירה כלייתית של לויקוציטים ותצהיר כלייתי של חלבונים בעכברי MRL/lpr המועדים לזאבת
Chapters
Summary June 8th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות זאבת בעכברים. שני הליכים נוספים מוצגים כדי לאפיין זאבת נפריטיס בהתבסס על חדירת תאים ותצהיר חלבון בכליות.
Transcript
שיטות אלה יכולות לעזור לחקור את ההתקדמות של דלקת כרונית הקשורה לכליות בחולי זאבת. אנו מציעים חלופה אמינה וחסכונית שניתן להשתמש בה כדי לפקח על מהלך המחלה בזאבת. התחילו לחטא את מכסה המנוע על ידי ריסוס 70% אתנול והניחו יריעת פלסטיק סטרילית על המשטח.
לאחר מכן להכין טיפים, צינורות 1.5 מיליליטר פיפטה לאסוף כ 20 microliters של השתן. קח את הכלוב ורסס 70% אתנול לפני הנחתו בתוך מכסה המנוע. לאחר מכן, החזיקו את העכבר ביד אחת והשתמשו ביד השנייה כדי לעסות בעדינות את אזור הגחון מלמעלה למטה.
באמצעות צינור 1.5 מיליליטר או פיפטה, לאסוף את השתן ישירות. או אם טיפות הדגימה אוספות אותו מיריעת הפלסטיק. ואז להחזיר את העכבר לכלוב.
חותכים את הכליות המנותחות לגודל גרגר ומתעכלים בחמישה מיליליטר של חיץ עיכול המכיל קולגן ו-DNase 1 במדיום RPMI 1640 המכיל HEPES למשך שעה אחת עם טלטול עדין מתמשך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר כקרח המכיל 10 מילימולר של EDTA ודוגרים במשך 10 דקות על קרח. ואז מערבלים את ההשעיה פעמיים.
מאוחר יותר, לסנן את תרחיף התא דרך מסננת 100 מיקרומטר ולשטוף עם 10 מיליליטר של HBSS מלא. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכן תמיסת פרקול איזוטונית של 30, 37 ו-70% מלאי והוסף שכבה של תמיסת פרקול 37% על גבי תמיסת 70%.
להשעות מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של 30% פרקול איזוטוני מניות. באמצעות פיפטה של פסטר נטען באיטיות 37% מחמישה מיליליטרים למעלה ו-70% מחמישה מיליליטר בתחתית, מה שהופך את המלאי לאיזוטוני פרקול הדרגתי. לאחר מכן, צנטריפוגה עם מספר תשע למעלה ומספר אפס למטה ב 1000 פעמים G במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לאסוף לויקוציטים מן הממשק 37 עד 70% ולהשעות אותם מחדש בחמישה מיליליטר של C 10. שוב, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להשעות מחדש את כדור התא בשלושה מיליליטר של חיץ פקס צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יש להשליך את הסופר-נאטנט ולהשאיר כ-50 מיקרוליטרים מהנפח הכולל. הוסף 50 מיקרוליטרים של בלוק קולטן FC לכל צינור. בעקבות תערובת זו דגירה על קרח בחושך במשך 10 דקות.
מאוחר יותר, להוסיף שני מיליליטר של חיץ פקס לשטיפה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatent משאיר כ 50 microliters של נפח הכולל. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של צבע פלואורסצנטי מתאים ולתת לו לעמוד במשך 15 עד 30 דקות על קרח.
הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים לכל שפופרת המכילה CD 138 סגול מבריק שבעה 11 ו-CD 45 Alexa Fluor 700 ודגרו על קרח בחושך במשך 15 עד 30 דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר פקס. צנטריפוגה ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant על ידי ואקום משאיר כ 50 microliters של נפח הכולל. מאוחר יותר, להשעות מחדש את כדור התא ב 200 microliters של PBS. כדי לאסוף את הדגימה להטמיע את חצי הכליה בקריומולד הפלסטי הקטן עם תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית.
לאחר מכן הוסיפו קרח יבש לקופסת קצף פוליסטירן והניחו בזהירות את הקריומולד על גבי הקרח היבש. לאחר מכן, להסיר את cryomold, לעטוף אותו ברדיד אלומיניום ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר מכן לתקן את יבש ארבעה מיקרומטר חלקים עם אצטון קר במשך 10 דקות.
לאחר תיקון השקופיות, יש לייבש באוויר למשך 0.5 עד שעה ולאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס לזמן קצר או מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך זמן רב. כדי להכתים את הדגימות, החזירו את השקופיות באצטון קר למשך 5 עד 10 דקות ותנו למקטעים להתחמם לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעזרת עט טפיחה, ציירו עיגול הידרופובי סביב הקטע ותנו לו להתייבש.
לאחר מכן הניחו את השקופיות ב-TBS בצנצנת קופלנד למשך 20 דקות ונערו בעדינות על ידי הנחת הצנצנת על השייקר. לאחר מכן, לשפוך את TBS ולמלא את הצנצנת עם TBS 5% BSA ו 0.1% TW 20. לאחר מכן, דגרו את הצנצנת למשך 20 דקות על ידי ניעור עדין על השייקר.
לאחר מכן, הוצא את השקופיות ומחק את החלק התחתון של השקופיות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של נוגדנים מצומדים C3 מתאימים ל-C ול-IgG2 APE למקטע והדגירו את טמפרטורת החדר בתא לח למשך שעה. יש לשטוף את המקטע שלוש פעמים ב-PBS 5%BSA ו-0.1% TW 20 במשך 10 דקות על השייקר ולאחר מכן לנער את המגלשות.
הרכב את הקטע עם מגיב נגד דהייה ולאחר מכן עם כיסוי להחליק. לאחר מכן אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עד לצפייה מתחת למיקרוסקופ. לניתוח תמונה באמצעות תוכנת Image J, התווה את האזור הרצוי.
לאחר מכן, הגדר פרמטרים סטנדרטיים על ידי לחיצה על נתח ואז הגדר מדידות ומדידת שטח כדי לקבל את התוצאות. לאחר מכן, העבר את הנתונים המתקבלים מחלונות המדידה לגיליון אלקטרוני. לאחר שתסיים, לחץ על נתח כדי למדוד את האזור ולהעביר את הנתונים שוב לגיליון האלקטרוני הקודם.
רמות החלבון בשתן של עכברי MRL LPR זוהו עם הזמן, שם הם טופלו עם פוספט חצץ מלח כקבוצת הביקורת ולקטובצילוס ראוטרי כקבוצת הטיפול. קבוצת העכברים שטופלה ב-L.reuteri בהתקדמות פרוטאינוריה אגרסיבית יותר מקבוצת הביקורת. ניתוח הפקס בוצע עבור לויקוציטים בכליות מבודדים כדי לנתח את תאי הפלזמה.
יתר על כן, העכברים טופלו עם vancomycin או vancomycin יחד עם Escherichia coli דנ"א דו-גדילי. למרות שדנ"א דו-גדילי של Escherichia coli היה צפוי לגרום לחדירת הכליות, לא נמצא הבדל משמעותי באחוז תאי הפלזמה. המשלים C3 ו- IgG2a זוהו באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים על מקטעי כליות MRL IPR נקבות.
הגורמים הסביבתיים היעילים בתצהיר הכליות של C3 ו- IgG2a הושוו עבור לחם העכברים הפנימי במתקן החיות ואלה שנרכשו מספק. הניתוח האימונוהיסטוכימי לא הראה הבדל בין שתי הקבוצות. הוספת כל שכבה של פתרון ISO 20 Percoll באחוזים יכולה להיות מאתגרת, ואם הם מתערבבים אתה צריך להתחיל מחדש.
הליך זה מסייע עם ציטומטר זרימה וניסויים in vitter, כך שאתה לא יכול לחקור את סוג תאי הכליה השונים של אוכלוסיות. הליך זה מאפשר לנו לחקור את החדירות של תאי B בכליות ואין הרבה מידע בספרות.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
