通过乙基甲烷硫素突变在小谷物作物中靶向诱导局部病变(TILLING)种群的发展

该协议详细介绍了在小谷物作物中通过EMS突变发生具有高突变频率的强健的耕种种群的发展。耕种种群可用于功能基因组学，以及小谷物作物的遗传空间基因发现。使用这种技术开发的直到丁体种群具有高突变频率，此协议可应用于任何基因型。

基于 Cel-1 测定的突变检测可以使用基本的实验室设备进行。最重要的步骤是确定最佳 EMS 浓度。因此， EMS 剂量曲线应专门为个人群体.

首先，在6个250毫升的玻璃瓶中浸泡100个种子，每个种子具有感兴趣的基因型，其中含有50毫升蒸馏水。在室温下以 100 RPM 摇动 8 小时，进行振动。然后，在烟气罩中，通过混合 EMS 液体和蒸馏水，准备 50 毫升五种不同浓度的 EMS 溶液。

燃烧后，从五个烧瓶中抽取水。在含有吸收种子的五个烧瓶中加入50毫升EMS溶液。在 75 RPM 和室温下摇动烧瓶 16 小时。

现在，将 EMS 溶液倒入空废瓶中，将经过处理的种子倒入放在空废瓶上的奶酪布上，以单独收集每次处理。使用额外的水来帮助浇灌种子。此外，将几毫升 EMS 不活化溶液喷洒到受污染的烧瓶壁上。

将用过的移液器尖端浸入溶液中 24 小时。通过添加一卷 EMS 停用解决方案来治疗 24 小时，使已使用的 EMS 解决方案处于非活动状态。使用扭结，将 EMS 处理的种子放在奶酪布内，并在自来水下洗涤两小时。

洗涤后，将每个种子分别移植到含有盆栽土壤的根部调节器中。在20至25摄氏度的温度下生长植物，16小时光。移植15天后，检查植物并计算未发芽的种子数量。

记录植物生存数据。如果存活率在40-60%以内，则使用经过修饰的浓度进行第二轮剂量优化，直到在诱变实验后达到40至60%的所需致命性，将M2植物的叶组织收集到96井组织收集盒中。组织是从自有M1植物中生长的M2植物。

每个 M1 工厂显示一个 M2 工厂。根据制造商的建议，使用植物DNA提取试剂盒提取DNA，并采用DNA纯化系统。然后，将两个微升的DNA提取物加载到有16个插槽的LV板中。

使用波长为 260 和 280 纳米的分光光度计量化 DNA。用无核酸酶水稀释DNA浓度至每微升25纳米。通过将四个 96 井块中每井的 DNA 组合到池板中，同时保持每个样品的行和柱标识，创建四次 200 微升的 DNA 池。

接下来，准备一个PCR主混合管的基因特定的底转，通过添加到每个管PCR缓冲液，向前和反向底转，和DNA聚合根据手稿。将主混合到 96 孔 PCR 板的孔中。然后，添加池化的 DNA 模板。

将 PCR 管加载到热循环器中，并使用接触型材在热循环器上运行 PCR 反应。为了在不匹配的DNA之间产生异质复用，在不同的程序中孵育热循环器中的PCR产品。然后，将2.5微升自制的Cel-1内核糖酶添加到每个杂化PCR产品中。

在45摄氏度下孵育45分钟。之后，通过添加2.5微升0.5摩尔EDTA在pH8终止Cel-1反应。将每个 Cel-1 处理的产品的 30.5 微升与 5 微升染料混合到 3%的 agarose 凝胶上，以 100 伏特运行两个半小时。

为了去组织突变池，通过运行两个PCR反应的单个M2DNA，第一反应包含2.5微升的M2DNA和2.5微升的野生类型DNA，第二反应只包含5微升的M2DNA，确定突变体的酶度。该协议显示了EMS小谷物作物的变异和突变的特性。剂量曲线指示三种不同小麦所需的 50% 存活率的最佳 EMS 剂量。

M2种群中容易识别的表型的存在证实了小谷物种群中诱变的有效性。以下是M2 TILLING种群中的突变表型、大麦M2种群中的白化病突变体、大麦M2种群中的氯突变体、Aegilops tauschii M2种群中粉红色变色的变异突变体以及Triticum单体M2种群中的低烧结突变体。在阿加罗斯凝胶平台上使用Cel-1的突变识别显示，通过独特的切割带在12个突变池中识别出一个潜在的突变池。

突变池的去卷积决定了突变的酶性，并帮助跟踪突变到单个样本。A4池具有异质突变，在方框4和方框4野生型DNA样本中均有裂开带表示。H5池包含同源突变，因为独特的切割带只存在于方框5 H5野生型DNA样本中。

最重要的步骤是确定 EMS 的最佳浓度，以达到 40 到 60% 的致命率。一旦一个具有高突变频率的 TILLING 种群被开发出来，它可用于任何感兴趣的基因的功能表征。此外，种群可能是作物改良有用基因变异的来源。

TILLING 已广泛应用于模型和作物的功能基因组研究。获得的突变范围可以是错位、敲除、静默，甚至错用形式。Ems 是一个突变。

因此，在处理 EMS 时，请使用适当的个人防护设备。去污染剩余的溶液和用过的移液器提示。