Utvikling av målretting indusert lokale lesjoner i genomer (TILLING) populasjoner i små korn avlinger av etanol Methanesulfonate mutagenese

Denne protokollen beskriver utviklingen av robuste TILLING populasjoner med høy mutasjonsfrekvens ved EMS mutagenese i små kornavlinger. TILLING populasjoner kan brukes til funksjonell genomikk, samt for fremover genetisk plass genoppdagelse i små korn avlinger. TILLING-populasjonene som er utviklet ved hjelp av denne teknikken, har høye mutasjonsfrekvenser, og denne protokollen kan brukes på alle genotyper.

Cel-1-analysen basert mutasjonsdeteksjon kan utføres ved hjelp av grunnleggende laboratorieutstyr. Det viktigste trinnet er å bestemme den optimale EMS-konsentrasjonen. Derfor bør en EMS doseringskurve gjøres spesielt for den enkelte populasjon.

Til å begynne med, suge 100 frø med genotype av interesse i hver av seks 250 milliliter glass kolber, som inneholder 50 milliliter destillert vann. Rist ved 100 RPM i åtte timer ved romtemperatur for imbibition. Deretter, i en røykhette, forberede 50 milliliter EMS-løsninger av fem forskjellige konsentrasjoner ved å blande EMS væske og destillert vann.

Etter imbibition, dekantere vannet ut av fem flasker. Tilsett 50 ml EMS-løsning i hver av de fem kolbene som inneholder imbibed frø. Rist kollene i 16 timer ved 75 o/min og romtemperatur.

Dekanter EMS-løsningen i en tom avfallsflaske og hell de behandlede frøene på ostekluen plassert på en tom avfallsflaske for å samle seg separat for hver behandling. Bruk ekstra vann for å helle frøene. Spray også flere milliliter ems inaktiverende løsning på veggen av forurensede flasker.

Og senk brukte pipettespisser i løsningen i 24 timer. Inaktiver den brukte EMS-løsningen ved å legge til ett volum ems inaktiverende løsning for å behandle i 24 timer. Bruk et twist slips, hold EMS behandlede frø inne i cheesecloth og vask under rennende vann fra springen i to timer.

Etter vask, transplanter hvert frø individuelt til rottrenere som inneholder pottejord. Dyrke planter på 20 til 25 grader Celsius for en 16 timers lysperiode. Etter 15 dager med transplantasjon, sjekk plantene og telle antall frø som ikke klarte å spire.

Registrere data om planteoverlevelse. Hvis overlevelsesraten ikke er innenfor 40 til 60% gjennomføre en andre runde med dosering optimalisering med en modifisert konsentrasjon før du oppnår ønsket dødelighet på 40 til 60%Etter mutagenese eksperiment, samle bladvev av M2 planter i en 96 brønnvev samling boks. Vev samles fra M2 planter som ble dyrket fra selvstyrte M1 planter.

En M2-plante er vist fra hvert M1-anlegg. Trekk ut DNA ved hjelp av et plante-DNA-ekstraksjonssett med et DNA-rensesystem etter produsentens anbefalinger. Deretter laster du to mikroliter av DNA-ekstraktet i LV-plater med 16 spor.

Kvantifisere DNA ved hjelp av et spektrofotometer ved bølgelengder på 260 og 280 nanometer. Fortynn DNA-konsentrasjonen til 25 nanogram per mikroliter med kjernefritt vann. Lag fire ganger DNA-bassenger med 200 mikroliter ved å kombinere DNA fra hver brønn i de fire 96 brønnblokkene i en bassengplate samtidig som rad- og kolonneidentiteten til hver prøve opprettholdes.

Deretter forbereder du et PCR master mix tube for genspesifikke primere ved å legge til i hvert rør PCR buffer, fremover og omvendt primere, og DNA polymerase i henhold til manuskriptet. Aliquot master mix inn i brønnene av en 96 brønn PCR plate. Deretter legger du til den samlede DNA-malen.

Last PCR-rørene inn i en termisk cycler, og bruk en touchdown-profil til å kjøre PCR-reaksjonen på den termiske cycleren. For å generere heteroduplexes mellom mismatched DNAs, inkubere PCR produkter i termisk cycler i et annet program. Deretter legger du til 2,5 mikroliter hjemmelaget Cel-1-endonukleær til hvert av de heteroduplexed PCR-produktene.

Inkuber i 45 minutter ved 45 grader Celsius. Deretter avslutter cel-1-reaksjonen ved å legge til 2,5 mikroliter på 0,5 molar EDTA ved pH åtte. Legg 30,5 mikroliter av hvert Cel-1-behandlet produkt blandet med fem mikroliter fargestoff på en 3% agarose gel og løp på 100 volt i to og en halv time.

For å dekonvolutere muterte bassenger, bestem mutantenes zygositet ved å kjøre to PCR-reaksjoner for individuell M2 DNA der den første reaksjonen inneholder 2,5 mikroliter M2 DNA og 2,5 mikroliter av vill type DNA, og den andre reaksjonen inneholder bare fem mikroliter M2 DNA. Denne protokollen viser EMS mutagenizing av små kornavlinger og karakterisering av mutant. Doseringskurven indikerer optimale EMS-doser for ønsket 50% overlevelse for tre forskjellige arter av hvete.

Tilstedeværelsen av lett identifiserbare fenotyper i M2-befolkningen bekrefter effektiviteten av mutagenese i småkornpopulasjoner. Her er fire eksempler på mutant fenotyper i M2 TILLING populasjoner, en albino mutant i en bygg M2 befolkning, en klorin mutant i en bygg M2 befolkning, en spraglete mutant med rosa misfarging i en Aegilops tauschii M2 befolkning, og en lav-tillering mutant i en Triticum monococcum M2 befolkning. En mutant identifikasjon ved hjelp av Cel-1 på agarose gel plattformer viser en potensiell mutant pool identifisert ut av 12 mutant bassenger av unike spaltet band.

Dekonovolution av muterte bassenger bestemte zygosity av mutasjon og bidro til å spore mutasjonen ned til individuelle prøver. A4-bassenget hadde heterozygous mutasjoner, indikert av spaltede bånd i både Box 4 og Box 4 wild type DNA-prøver. H5-bassenget inneholdt homozygøse mutasjoner da unike spaltede bånd bare var til stede i Boks 5 H5 wild type DNA-prøve.

Det viktigste trinnet er å bestemme den optimale konsentrasjonen av EMS for å oppnå 40 til 60% dødelighet. Når en TILLING populasjon med høy mutasjonsfrekvens er utviklet, kan den brukes til funksjonell karakterisering av ethvert gen av interesse. I tillegg kan befolkningen være en kilde til nyttig genetisk variasjon for avlingsforbedring.

TILLING har blitt brukt mye for funksjonelle genomiske studier i modell- og avlingsanlegg. Utvalget av mutasjoner oppnådd kan være feil, knockouts, stille, eller til og med feilpliced former. EMS er en mutagen.

Bruk derfor egnet personlig verneutstyr under håndtering av EMS. Dekontaminer rester og brukte pipettespisser.