11,369 Views
•
08:36 min
•
July 16, 2019
DOI:
Detta protokoll detaljer utvecklingen av robusta TILLING populationer med hög mutation frekvens av EMS mutagenesis i små korn grödor. TILLING populationer kan användas för funktionell genomik, samt för framåt genetiska rymdgen upptäckt i små säd grödor. DE TILLING-populationer som utvecklats med hjälp av denna teknik har höga mutationsfrekvenser, och detta protokoll kan tillämpas på vilken genotyp som helst.
Cel-1-analysen baserad mutation upptäckt kan genomföras med hjälp av grundläggande lab utrustning. Det viktigaste steget är att bestämma den optimala EMS-koncentrationen. Därför bör en EMS doseringskurva göras speciellt för den enskilda befolkningen.
Till att börja med blöt 100 frön med genotypen av intresse i var och en av sex 250 milliliter glaskolvar, som innehåller 50 milliliter destillerat vatten. Skaka vid 100 RPM i åtta timmar vid rumstemperatur för imbibition. Sedan, i en rökhuva, förbered 50 milliliter EMS-lösningar av fem olika koncentrationer genom att blanda EMS-vätska och destillerat vatten.
Efter imbibition, dekantera vattnet ur fem kolvar. Tillsätt 50 milliliter EMS-lösning i var och en av de fem kolvar som innehåller imbibed frön. Skaka kolvarna i 16 timmar vid 75 RPM och rumstemperatur.
Nu, dekantera EMS-lösningen i en tom avfallsflaska och häll de behandlade fröna på cheesecloth placeras på en tom avfallsflaska för att samla separat för varje behandling. Använd extra vatten för att hjälpa hälla av fröna. Spruta också flera milliliter AV EMS-inaktiverande lösning på väggen av förorenade kolvar.
Och sänk ner använda pipettspetsar i lösningen i 24 timmar. Inaktiv den använda EMS-lösningen genom att lägga till en volym EMS-inaktiverande lösning för att behandla i 24 timmar. Med hjälp av en twist tie, håll EMS behandlade frön inuti cheesecloth och tvätta under rinnande kranvatten i två timmar.
Efter tvätt, transplantera varje frö individuellt till rot utbildare som innehåller krukväxtjord. Odla växter vid 20 till 25 grader Celsius under en 16 timmars ljusperiod. Efter 15 dagars transplantation, kontrollera växterna och räkna antalet frön som misslyckades med att gro.
Registrera data över växtöverlevnad. Om överlevnaden inte är inom 40 till 60%genomföra en andra omgång av dosering optimering med en modifierad koncentration tills uppnå den önskade dödligheten på 40 till 60%Efter mutagenesis experimentet, samla bladvävnaden av M2 växter i en 96 väl vävnad insamling låda. Vävnad samlas in från M2 växter som odlades från selfed M1 växter.
En M2-anläggning visas från varje M1-anläggning. Extrahera DNA med hjälp av en anläggning DNA extraktionssats med ett DNA-reningssystem efter tillverkarens rekommendationer. Därefter, ladda två mikroliter av DNA-extraktet i LV-plattor med 16 platser.
Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer vid våglängder på 260 och 280 nanometer. Späd DNA-koncentrationen till 25 nanogram per mikroliter med kärnansfritt vatten. Skapa fyra gånger DNA-pooler av 200 mikroliter genom att kombinera DNA från varje brunn i de fyra 96 brunnsblocken i en poolplatta samtidigt som rad- och kolumnidentiteten för varje prov bibehålls.
Därefter förbereda en PCR master mix tube för genspecifika primers genom att lägga till i varje rör PCR buffert, framåt och omvänd primers, och DNA polymeras enligt manuskriptet. Aliquot befälhavaren blanda in brunnarna i en 96 väl PCR-platta. Lägg sedan till den poolade DNA-mallen.
Ladda PCR-rören i en termisk cycler, och använd en touchdown-profil för att köra PCR-reaktionen på termiskcykleren. För att generera heteroduplex mellan missmatchade DNAs, inkubera PCR-produkter i termisk cycler i ett annat program. Lägg sedan till 2,5 mikroliter av hemlagad Cel-1 endonuclease till var och en av de heteroduplexade PCR-produkterna.
Inkubera i 45 minuter vid 45 grader Celsius. Därefter avslutar du Cel-1-reaktionen genom att tillsätta 2,5 mikroliter på 0,5 molar EDTA vid pH åtta. Ladda 30,5 mikroliter av varje Cel-1-behandlad produkt blandad med fem mikroliter färgämne på en 3%agarosgel och kör på 100 volt i två och en halv timme.
För att deconvolute mutant pooler, bestämma zygosity mutanter genom att köra två PCR reaktioner för enskilda M2 DNA där den första reaktionen innehåller 2,5 mikroliter av M2 DNA och 2,5 mikroliter av vilda typ DNA och den andra reaktionen innehåller endast fem mikroliter M2 DNA. Detta protokoll visar EMS mutagenizing av små säd grödor och karakterisering av mutant. Doseringskurvan indikerar optimala EMS-doser för de önskade 50%-överlevnadsgraderna för tre olika arter av vete.
Förekomsten av lätt identifierbara fenotyper i M2 befolkningen bekräftar effektiviteten av mutagenes i små korn populationer. Här är fyra exempel på de muterade fenotyper i M2 TILLING populationer, en albino mutant i en korn M2 befolkning, en klorina mutant i en korn M2 befolkning, en brokig mutant med rosa missfärgning i en Aegilops tauschii M2 population, och en låg-tillering mutant i en Triticum monococcum M2 population. En mutant identifiering med Cel-1 på agarrose gel plattformar visar en potentiell mutant pool identifieras av 12 mutant pooler av unika cleaved band.
Deconvolution av mutant pooler bestäms zygosity av mutation och hjälpte till att spåra mutationen ner till enskilda prover. A4 poolen hade heterozygous mutationer, som anges av klyvade band i både Box 4 och Box 4 vilda typ DNA-prover. H5 poolen innehöll homozygous mutationer som unika cleaved band var endast närvarande i Box 5 H5 vild typ DNA-prov.
Det viktigaste steget är att bestämma den optimala koncentrationen av EMS för att uppnå 40 till 60%dödlighet. När en TILLING befolkning med en hög mutation frekvens har utvecklats det kan användas för funktionella karakterisering av någon gen av intresse. Dessutom kan befolkningen vara en källa till användbar genetisk variation för gröda förbättring.
TILLING har använts i stor utsträckning för funktionella genomiska studier i modell- och grödor. Den rad av mutationer som erhållits kan vara felents, knockouts, tyst, eller ens misspliced former. EMS är en mutagen.
Använd därför lämplig personlig skyddsutrustning medan du hanterar EMS. Dekontaminera överblivna lösningar och använda pipettspetsar.
Beskrivs är ett protokoll för att utveckla en inriktning inducerade lokala lesioner i Genomes (TILLING) population i små spannmålsgrödor med användning av etylmetanesulfonat (EMS) som mutagen. Det finns också ett protokoll för Mutations detektering med hjälp av cel-1-analysen.
Read Article
Cite this Article
Singh, L., Schoen, A., Mahlandt, A., Chhabra, B., Steadham, J., Tiwari, V., Rawat, N. Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis. J. Vis. Exp. (149), e59743, doi:10.3791/59743 (2019).
Copy