Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss
Chapters
Summary September 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera 5-hydroximetylcytosin i celler och hjärnvävnader, utnyttjar immunofluorescensfärgning och DNA-punktblot-metoder.
Transcript
Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka 5-hydroxymetylcytosin i celler och hjärnan vävnader med hjälp av immunofluorescens, den nya metoden och DNA dot-blot. 5-hydroxymethylcytosin, dvs 5hmC, mildras epigenetiska modifiering, spelar viktig funktion i regleringen genuttryck och involverade i flera neurologiska sjukdomar.
Egentligen kan våra metoder användas för att upptäcka 5hmC i flera celler och vävnaderna. Det är bekvämt och kan utföras med vanliga utrustningar i labbet. Börja med att placera musen uppåt på en plastbräda och fixering av varje lem med tejp.
Använd kirurgisk sax för att skära igenom huden och muskeln, och öppna brösthålan. Exponera hjärtat och skär av en liten del av höger förmak med fin kirurgisk sax. Med hjälp av en 10-milliliter disponibel, steriliserad spruta, genomsyra musen från vänster kammare med kalla PBS.
Sedan, granska musen med 4%PFA tills den är stel. Öppna sedan skallen med bentens och ta bort hjärnan. Placera hjärnan i en 15-milliliter centrifugering röret fyllt med fem milliliter av 4%PFA och förvara den på fyra grader Celsius.
Efter 24 timmar, överföra hjärnan till en 30%sackaros lösning och lämna den på fyra grader Celsius för fullständig uttorkning. Före snittning, imbed hjärnan i optimal skärtemperatur förening och svalna till minus 20 grader Celsius i minst en timme. Sektion hjärnprover vid en tjocklek av 20 till 40 mikrometer med hjälp av en kryostat mikrotom.
Samla sektioner i PBS och förvara vid fyra grader Celsius. Plocka upp hjärnan delar av intresse och sätta dem i en 24-brunns platta med PBS. Tvätta sektioner med PBS på en skakre i 10 minuter.
Ta bort PBS och behandla med förvärmd en-molar saltsyra vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Saltsyra är frätande och ber vi dig att förbereda den i kemikaliens stadga. Sedan, tvätta proverna tre gånger med PBS i fem minuter och blockera dem med PBS som innehåller 3%normal get serum och 0,1%Triton X-100.
Låt proverna vara kvar på en skakre i rumstemperatur i en timme. Lägg till specifika primära antikroppar till sektionerna och inkubera över natten vid fyra grader Celsius på en shaker. Nästa dag, ta ut proverna och lämna dem i rumstemperatur i en timme.
Tvätta proverna tre gånger med PBS och tillsätt sekundära antikroppar. Täck plattan med aluminium och låt den vara i rumstemperatur i en timme medan du skakar. Efter inkubationen, tvätta proverna tre gånger med PBS och montera dem på glid.
Tillsätt 100 till 150 mikroliter av anti-fade monteringsmedium, täck med ett premiumöverdrag glas, och täta med nagellack. Avbilda hjärnsektionerna med ett regelbundet eller konfokalmikroskop. För att isolera genomisk DNA, börja med att dissekera hippocampus, cortex och lillhjärnan vävnader på en iskyld maträtt.
Tillsätt en milliliter DNA-lysbuffert och slipa vävnaderna. Överför provet till ett rent mikrocentrifugrör och tillsätt 250 mikrogram proteinas-K för varje 600 mikroliter av lysbuffert. Tillsätt sedan ca 50 mikrogram RNase A per prov och inkubera i minst 12 timmar vid 37 grader Celsius.
Efter inkubationen, tillsätt en lika stor volym av fenol kloroform isoamylalkohol och blanda noggrant. Centrifugera blandningen enligt manuskriptriktningar och överför supernatanten till ett nytt rör. Tillsätt 600 mikroliter av kloroform till supernatanten, blanda noggrant, och centrifug enligt manuskriptriktningar.
Överför supernatanten till ett nytt rör och tillsätt 500 mikroliter isopropanol. Blanda noggrant och centrifug igen för att fälla ut DNA: t. Efter centrifugeringen kasserar du supernatanten, och tvättar DNA-pelleten med 70%etanol enligt manuskriptriktningar.
Lufttorka DNA-pelleten helt och sedan, lös upp den i Tris-HCl buffert. Före start, förbereda de erforderliga lösningarna och provblandningen enligt manuskriptriktningar. Denature DNA-provet genom att värma upp det till 100 grader Celsius i 10 minuter och sedan, placera den på is.
Skär lämplig storlek på ett nylonmembran och skölj det med 6X SSC. Placera membranet på en punkt-blot-apparat och anslut vakuumpumpen. Spot sex-microliter prickar på membranet och hybridisera i 30 minuter vid 80 grader Celsius.
Sedan, blockera provet membranet med fettfri mjölk och Tris-buffrad saltlösning, eller TBS, i en timme. Tillsätt polyklonala kanin anti-5-hydroxymetylcytosin antikropp till membranet och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, lämna provmembranet i rumstemperatur i en timme, tvätta sedan membranet tre gånger med TBS.
Inkubera membranet med den sekundära antikroppen antiinbar i 30 minuter och sedan, tvätta tre gånger med TBS. Visualisera signalerna om chemiluminescens och kvantifiera deras intensitet. Detta protokoll kan användas för att visualisera 5-hydroxymetylcytosin, eller 5hmC, i hippocampus av vuxna möss.
Immunofluorescens med antikroppar mot neuronala celler, 5hmC avslöjar att det finns en anrikning av 5hmC i nervceller. Dynamiken i 5hmC under neuronal utveckling kan bestämmas med en dot-blot analys av DNA-prover isolerade från proliferering och differentierade vuxna neurala stamceller. Globala nivåer av 5hmC ökar signifikant under differentiering och nivån på 5hmC i nervceller är högre än i neurala stamceller.
Det viktigaste steget i denna metod är att se till att fullständig denaturering av DNA-prover.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
