Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Оценка миграции лимфоцитов в системе трансмиграции Ex Vivo
Chapters
Summary September 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этом протоколе лимфоциты помещаются в верхнюю камеру системы трансмиграции, отделенную от нижней камеры пористой мембраной. Хемокин добавляется в нижнюю камеру, что индуцирует активную миграцию вдоль градиента хемокина. После 48 ч лимфоциты учитываются в обеих камерах для количественной оценки трансмиграции.
Transcript
Лимфоцитная трансмиграция является важной особенностью любого иммунного ответа. Таким образом, этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователю оценить подвижность лимфоцитов в четко определенной системе in vitro. Основным преимуществом этого метода является то, что различные хемокины могут быть оценены, чтобы определить их эффективность индуцирования миграции в недавно определенных клетках, таких как группа 2 врожденных лимфоидных клеток, или ILC2.
Вторым преимуществом является то, что ингибиторы или биологические методы лечения, направленные на блокирование конкретных путей хемокина могут быть проверены с помощью этого метода до выполнения более дорогостоящих экспериментов с животными. Начните с excising легких и селезенки от усыпанных ova-обработанных мышей и женщин используя 2 до 3 животных в группу. Поместите вырезанные ткани в отдельные диссоциацианые трубки в зависимости от типа тканей и пола животных.
Поместите легочную ткань в 500 микролитров средств диссоциации легких в диссоциарной трубке, поместите трубку в автоматизированный диссоциатор ткани и отмежевать ее с помощью протокола легких. Повторите эти шаги в общей сложности два раза. Чтобы разобщить ткани селезенки, поместите его в 500 микролитров полного RPMI сми в диссоциатор, а затем использовать протокол селезенки.
Работая в кабинете биологической безопасности, используя стерильную технику отныне, фильтруйте каждую разобщенной ткани через 40-микрометровый клеточный ситечко и собирайте в 50-миллилитровые конические трубки. Промыть диссоциарные трубки, содержащие гомогенаты легких с пятью миллилитров дополнительных средств диссоциации легких, трубки, содержащие селезенки гомогенатов с пятью миллилитров полного RPMI, и фильтр их содержимое через фильтры, используемые для их соответствующих тканей. Для дальнейшего разобщения легочной ткани, инкубировать легких гомогенатов в течение 15 до 30 минут в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%углекислого газа.
Затем добавьте пять миллилитров полного RPMI как к гомогенатам легких и селезенки, так и к центрифуге. После отбрасывания супернатанта, объединить гранулы, содержащие спеноциты и клетки легких из группы животных того же пола в одну 50-миллилитровую коническую трубку. Добавьте 10 миллилитров полного RPMI к каждой трубке и повторно посовещение.
Определите общее количество ячеек с помощью автоматизированного счетчика ячеек. Отрегулируйте мужские и женские клеточные суспензии до 100 миллионов клеток на миллилитр в буфере разделения, а затем добавьте в пятимиллилитровую полистироловую трубку. После изоляции группы 2 врожденных лимфоидных клеток от 2/3 от общего числа клеток, описанных в рукописи, используйте оставшиеся клетки для cd4-положительной процедуры изоляции Т-клеток.
Чтобы начать CD4-положительную изоляцию Т-клеток, добавьте крысиную сыворотку к подвеске обогащения клеток CD4 T. Затем добавьте изоляционный коктейль в образец клетки и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Вихрь быстрых сфер в течение 30 секунд, и добавить в образец клетки для достижения разбавления 75 микролитров на миллилитр.
Аккуратно перемешать и инкубировать в течение 2 1/2 минут при комнатной температуре. Топ образцов с примерно двумя миллилитров разделения буфера до трех миллилитров, место пятими миллилитров труб в восьмикамерный легкое разделение магнита, и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем наконечник магнит вперед, и пипетка каждой ячейки подвески в чистой пятими миллилитровой трубки.
Добавьте 1,5 миллилитров RPMI без сыворотки в каждую трубку и центрифугу. Слейте супернатант, и resuspend CD4-положительных Т-клеток гранулы на 10 миллионов клеток на миллилитр в сыворотке свободной RPMI. Чтобы начать эту часть протокола, определите количество вставок Transwell, необходимых для эксперимента как для ILC2, так и для CD4-положительных Т-клеток, описанных в рукописи.
Аккуратно переместите трехмирновые вставки Transwell из средних рядов пластины из 24 к началу и нижним рядам той же 24-хорошой пластины с наконечником пипетки и руками в перчатках. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL17 до 1/3 скважин в среднем ряду пластины из 24 скважин. Добавьте 500 микролитров миграционных средств массовой информации с CCL22 к другим 1/3 скважин.
И, наконец, добавить 500 микролитров сыворотки без RPMI, не содержащие хемокина в последние 1/3 скважин. Этикетка крышки на пластине четко с именем соответствующих трансмиграционных средств массовой информации, размещенных в нижних скважинах. Затем поместите Transwell вставки обратно в скважины, содержащие различные процедуры.
Аккуратно добавьте 100 микролитров клеток CD4 T или ILC2 в верхний колодец каждой вставки, убедившись, что не смешивать или пипетки клеточной подвески вверх и вниз в Transwells. Этикетка крышку на пластине четко с типом ячейки размещены в каждой хорошо, и написать дату и время суток, что клетки были добавлены. Повторите этот процесс, начиная с удаления вставок Transwell с пластины до тех пор, пока все ячейки не будут помещены в вставки Transwell со средствами массовой информации.
После того, как клетки, представляющие интерес изолированы, наиболее важными шагами являются отслеживание хемокинов и типов клеток, которые помещаются в определенные скважины, чтобы аккуратно добавить клетки в верхние камеры, и, наконец, чтобы избежать ненужного контакта с трансмиграционными пластинами во время 48-часовой инкубации. Аккуратно поместите пластину в 37-градусный инкубатор по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и инкубировать в течение 48 часов, убедившись, что свести к минимуму контакт с пластиной в течение инкубации периода. После аккуратного удаления пластины из инкубатора, удалите все вставки Transwell из средних рядов в пустые колодцы чуть выше или ниже.
Соберите ячейки из верхних и нижних колодцев Transwell вставки в трубки помечены сверху или снизу с CCL17, CCL22, или средств массовой информации, с типом ячейки, и с номером репликации. Промыть нижние скважины 500 микролитров 1x PBS, собрать его в соответствующие трубы, и сделать то же самое для верхних скважин. Центрифуга труб при 378 г при комнатной температуре в течение пяти минут.
Используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить все супернатанты, а затем повторно использовать T ячейки и ILC2 гранулы с 50 микролитров 1x PBS. После удаления 10 микролитров клеточной подвески добавьте 90 микролитров 0,4%трипан синего цвета. Подсчитайте ячейки на автоматизированном счетчике ячеек.
И для каждого образца, рекордный процент жизнеспособности и количества клеток на миллилитр, и определить общее количество клеток на лечение в верхней и нижней камере. Когда выражение CCR4 оценивалось как на CD4-положительных Т-клетках, так и на ILC2 по цитометрии потока, не было никаких различий между мужскими и женскими хозяевами. Однако экспрессия CCR4 на клеточной основе на ILC2 была выше по сравнению с CD4-положительными Т-клетками.
Когда нижняя камера аппарата Transwell была заполнена необработанными средствами массовой информации культуры клеток, средствами массовой информации, содержащими CCL22, или средствами массовой информации, содержащими CCL17, менее 14% ячеек мигрировали в условиях контроля мультимедиа. В ответ на CCL22, оба типа клеток, независимо от того, были ли они от мужчин или женщин хозяев, ответил на CCL22. Кроме того, CCL22 индуцированных большую миграцию, чем CCL17 в мужской ILC2.
С другой стороны, CCL17 индуцированных значительную миграцию женских клеток CD4 T и ILC2 по сравнению со средствами массовой информации в одиночку. Лечение CCL17 не отличалось от средств массовой информации для мужских CD4-положительных Т-клеток или мужского ILC2. В неоптимальных условиях, когда пластина с клетками CD4 оставалась при комнатной температуре в течение первых 24 часов, а затем перемещалась в инкубатор, не было никакой миграции в сторону CCL22 и CCL17.
Кроме того, жизнеспособность клеток была особенно низкой для клеток в нижней камере, показывая важность использования правильных температур и условий, описанных в этом протоколе для достижения оптимальных результатов. Как только процедура трансмиграции будет завершена, следует увидеть значительную миграцию в химиокин, представляющий интерес по сравнению с скважинами контроля над средствами массовой информации. Если не наблюдается существенной миграции, можно предположить, что процедура не работает должным образом или что лимфоциты не реагируют на хемокин в вопросе.
Этот метод может быть широко использован для понимания миграции лимфоцитов, когда эти лимфоциты прошли широкий спектр инво лечения.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
