Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen
Summary December 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.
Transcript
Met behulp van intravitale microscopie maakt dit protocol de real-time visualisatie van darmweefsel mogelijk tot een eencellige resolutie en de studie van zeer dynamische processen zoals celafstoten. In combinatie met de standaard tracer experimenten, dit protocol maakt het mogelijk de identificatie van zowel darmdoorlaatbaarheid verstoringen in vivo en het onderscheid tussen para en transcellulaire doorlaatbaarheid. Dit protocol kan worden gebruikt als basis voor de ontwikkeling van aanvullende intravitale microscopie benaderingen voor het visualiseren van andere zeer dynamische cellulaire processen van belangen binnen verschillende weefsels.
Visuele demonstratie van deze methode is essentieel om de chirurgische voorbereidingsstappen te begrijpen en het levende dier zo te positioneren dat beeldverwerving op het darmslijmvlies mogelijk maakt. Schakel voor het begin van de procedure de basis- en scannerbox van een confocale laserscanmicroscoop in en druk op start om de computer in te schakelen. Start de software voor het verkrijgen van afbeeldingen en selecteer de juiste configuratie.
Als u de juiste afbeeldingsresolutie wilt instellen, selecteert u configuratie, hardware, resolutie, bitdiepte en 12. Selecteer onder het acquisitiemenu XYZT voor de beeldacquisitiemodus en stel de doelstelling in op 20 of 40X. Als u de sequentiële acquisitie-instelling wilt instellen, klikt u op zoeken en toevoegen en selecteren tussen frames.
Als u reeks één wilt configureren, schakelt u de zichtbare laserbox in. Stel fotomultiplier buis een op en definieer de emissie golflengte. Als u reeks twee wilt configureren, schakelt u de zichtbare laserbox in.
Stel fotomultiplier buis twee aan op en definieer de emissiegolflengte. Activeer vervolgens de juiste lasers. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teenknijpen, gebruik een wattenstaaf om zalf toe te passen op de ogen van de verdoofde muis en een incisie van één centimeter te maken in het linker ventrikelgebied van de buik.
Gebruik tangen om een drie tot vijf centimeter segment van de darm te exterioriseren. Maak twee kleine insnijdingen aan de boven- en onderkant van het darmsegment en introduceer een glazen micropipet in het darmlumen. Gebruik vervolgens elektrocauterisatie om het buitengeïnteriseerde darmsegment langs de anti-mesenterische kant te openen en het slijmvlies bloot te leggen.
Spoel het weefsel kort af met een zoutoplossing om het fecale gehalte te verwijderen. Voor het bevlekken van het darmslijmvlies oppervlak, van toepassing 100 microliter van een een milligram per milliliter van acriflavine oplossing in druppels op het blootgestelde slijmvlies oppervlak en laat de vlek te ontwikkelen gedurende drie minuten voor het uitwassen van de resterende oplossing met PBS. Breng vervolgens 100 microliters van een twee milligram per milliliter rhodamine dextran-oplossing in druppels aan op het slijmvlies voor incubatie van drie minuten voordat u met PBS wast.
Plaats vervolgens de verdoofde muis supine op een cover slide gemonteerd op de kamer gespoeld met 37 graden Celsius zoutoplossing, het aanpassen van de positie indien nodig, en plaats het preparaat op de omgekeerde microscoop stadium. Onmiddellijk na het plaatsen van de muis op het podium, zet de lichtbron en pas de XY positie totdat de verlichting as is gericht op het weefsel voorbereiding. Selecteer de juiste filterkubus om het gezichtsveld te selecteren.
Open de sluiter en gebruik de macro- en microwielen om zich te concentreren op het oppervlak van het darmslijmvlies. Pas de XY-positie aan om een gebied te vinden waarin meerdere villi kan worden gevisualiseerd in het gezichtsveld en wijzig de filterkubus om te controleren of de rhodamine dextran-kleuring ook zichtbaar is in dat gebied. Wanneer een interessegebied is geïdentificeerd, start u de beeldverwerving en selecteert u sequentie één om de laserkracht, versterking en compensatie voor reeks één aan te passen.
Selecteer vervolgens volgeop twee en pas de laserkracht, versterking en verschuiving voor serie twee aan. Als u het Z-stack-bereik wilt definiëren, opent u het inlevermenu met Z-stack. Gebruik het Z-access-besturingselement om je te concentreren op het oppervlak van het slijmvlies en klik op beginnen.
Focus op de onderste limiet van waar het signaal nog detecteerbaar is en klik op einde. Definieer het aantal Z-stacks, vermijd time-lapses langer dan twee minuten voor twee opeenvolgende tijdstippen en open het tijdmenu om minimaliseren te selecteren en te verwerven tot stoppen. Als u het regelgemiddelde wilt definiëren, selecteert u zoeken naar één, regelgemiddelde twee, zoekt twee en regelgemiddelde twee.
Stel vervolgens het formaat in op 1024 x 1024 pixels en de snelheid op 400 en klik op start. Darmeptheelcelspecifieke GGTase-tekort voorwaardelijke muizen ontwikkelden ernstige darmpathologie, zoals blijkt uit een toename van de histologische schadescore van de dunne darm en verhoogde darmeppilelbaarheid kan ook worden gedetecteerd via tracer in in-vivo experimenten met oraal toegediende FITC-dextran. Celvergieten gebeurtenissen kunnen worden geïdentificeerd als cellen bewegen uit de epitheliale monolaag in het lumen, wat leidt tot tijdelijke hiaten in het plafond van het epitheel die uiteindelijk worden gesloten door het contact tussen naburige cellen, een zogenaamde rits effect.
Deze hiaten worden waargenomen in zowel controle als GGTase tekort muizen, hoewel de frequentie van dit fenomeen hoger is in de laatste. Interessant is dat andere cellen ook lijken te nemen dextran. Deze zogenaamde doorlatende celgebeurtenissen komen ook vooral voor bij voorwaardelijke knock-outmuizen.
De immunosmet betrekking tot cytoskelet-gerelateerde en strakke knooppunteiwitten van belang kunnen worden uitgevoerd om specifieke doelen te identificeren die bijdragen aan potentiële epitheliale permeabiliteitsverstoringen die worden bepaald via intravitale microscopie. Deze methode kan worden gebruikt voor de analyse van andere verschijnselen op het oppervlak van het darmslijmvlies, zoals endotheliale lekkage of immuuneptheelcommunicatie in de context van darminfectie.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
