Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En intravital mikroskopi-baserad metod för att bedöma intestinal permeabilitet och epitelial cell shedding Performance
Summary December 3rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Med fördel av intravital mikroskopi möjliggör den metod som presenteras här realtid visualisering av intestinala epitelcell avgivande i levande djur. Därför är lokalt färgade intestinala mukosa (acriflavine och rhodamineB-dextran) av sövda möss avbildas upp till encellig upplösning med hjälp av confocal mikroskopi.
Transcript
Med hjälp av intravital mikroskopi möjliggör detta protokoll realtidsvisualisering av tarmvävnad upp till en encellig upplösning och studier av mycket dynamiska processer som cellspjut. I kombination med standard tracer experimenten, detta protokoll tillåter identifiering av både intestinala permeabilitet störningar i vivo och skillnaden mellan para och transcellulära permeabilitet. Detta protokoll skulle kunna användas som grund för utvecklingen av ytterligare intravital mikroskopi metoder för visualisering av andra mycket dynamiska cellulära processer av intressen inom olika vävnader.
Visuell demonstration av denna metod är avgörande för att förstå de kirurgiska förberedelse stegen och att positionera det levande djuret på ett sätt som underlättar bild förvärv på tarmen slemhinnan ytan. Innan du börjar proceduren, slå på bas och skanner låda av en confocal laserscanning mikroskop och tryck på start för att slå på datorn. Starta programvaran för bildanskaffning och välj lämplig konfiguration.
Om du vill ställa in lämplig bildupplösning väljer du konfiguration, maskinvara, upplösning, bitdjup och 12. Välj XYZT för bildanskaffningsläget under förvärvsmenyn och ange målet till 20 eller 40X. Om du vill ställa in inställningen för sekventiell förvärv klickar du på Sök och lägg till och markera mellan bildrutor.
Om du vill konfigurera sekvens ett aktiverar du rutan för synlig laser. Ställa in photomultiplierrör en till på och definiera utsläppsvåglängden. Om du vill konfigurera sekvens två aktiverar du den synliga laserrutan.
Ställ in fotomultiplierrör två till på och definiera utsläppsvåglängden. Aktivera sedan lämpliga lasrar. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, använd en bomullsknopp för att applicera salva på ögonen på den sövda musen och göra ett en centimeter snitt i den vänstra ventrikelregionen i buken.
Använd tång för att exteriöra en tre till fem centimeter segment av tarmen. Gör två små snitt i toppen och botten av tarmsegmentet och introducera en glasmikropipette i tarmlumen. Använd sedan elektrocauterisering för att öppna det exteriöra tarmsegmentet longitudinellt längs den anti-mesenteria sidan och exponera slemhinnan.
Skölj vävnaden kort med saltlösning för att ta bort fekalhalten. För färgning av tarmslemhinnans yta, applicera 100 mikroliter av en ett milligram per milliliter av acriflavinelösning i droppar på den exponerade slemhinnans yta och låt fläcken utvecklas i tre minuter innan du tvättar ut den återstående lösningen med PBS. Därefter applicera 100 mikroliter av en två milligram per milliliter rhodamine dextran lösning i droppar till slemhinnan för tre minuters inkubation innan tvätt med PBS.
Placera sedan den sövda musen supine på ett lock glida monterad på kammaren sköljs med 37 grader Celsius saltlösning, justera läget om det behövs, och placera beredningen på inverterade mikroskopet scenen. Omedelbart efter att du placerat upp musen på scenen, sätt på ljuskällan och justera XY-positionen tills belysningsaxeln är inriktad på vävnadspreparationen. För att kunna välja synfält väljer du lämplig filterkub.
Öppna slutaren och använd makro- och mikrohjulen för att fokusera på tarmslemhinnans yta. Justera XY-positionen för att lokalisera ett område där flera villi kan visualiseras inom synfältet och ändra filterkuben för att kontrollera att infärgningen av rhodamindextran också syns i det området. När ett område av intresse har identifierats, starta bilden förvärvet och välj sekvens ett för att justera lasereffekten, vinst och offset för sekvens ett.
Välj sedan sekvens två och justera lasereffekten, förstärkningen och förskjutningen för sekvens två. Om du vill definiera Z-stack-området öppnar du menyn för Z-stack-avlämning. Använd Z-åtkomstkontrollen för att fokusera på slemhinnans yta och klicka på Begin.
Fokusera på den nedre gränsen för var signalen fortfarande är detekterbar och klicka. Definiera antalet Z-stackar, undvika time-lapses längre än två minuter för två på varandra följande tidpunkter och öppna tidsmenyn för att välja minimera och förvärva tills stopp. Om du vill definiera radgenomsnittet väljer du sök ett, radgenomsnitt två, sök två och radgenomsnitt två.
Sedan att skaffa bilder, ställa in formatet till 1024 x 1024 pixlar och hastigheten till 400 och klicka på start. Intestinala epitelial cell-specifika GGTase bristfällig conditional mice utvecklat allvarliga intestinala patologi som framgår av en ökning av den histologiska skador poängen för tunntarmen och ökad intestinala epitelial permeabilitet kan också detekteras via spårämne i in-vivo experiment med hjälp av oralt administreras FITC-dextran. Cellutgivande händelser kunde identifieras som celler som rör sig ut ur epitelial monolayer i lumen, vilket leder till tillfälliga luckor i taket av epitelet som slutligen stängs av kontakten mellan angränsande celler, en så kallad dragkedja effekt.
Dessa luckor observeras i både kontroll och GGTase bristfälliga möss, även om frekvensen av dessa fenomen är högre i den senare. Intressant nog verkar andra celler också att ta upptag dextran. Dessa så kallade genomsläppliga cellhändelser förekommer också huvudsakligen hos villkorliga knockoutmöss.
Immunfärgning av cytoskelett-relaterade och snäva knutpunkter proteiner av intresse kan utföras för att identifiera specifika mål som bidrar till potentiella epitelial permeabilitet störningar bestäms via intravital mikroskopi. Denna metod kan användas för analys av andra fenomen på ytan av tarmslemhinnan, såsom endotelläckage eller immun epitelial kommunikation i samband med tarminfektion.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
