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इस प्रोटोकॉल का उपयोग हैचिंग से पहले अंडे के मामलों (ओथेके) को स्टरलाइज करके ग्लोटोबायोटिक अमेरिकी तिलचट्टे(पेरिप्लैनेटा अमेरिकाना)को स्थापित करने और बनाए रखने में किया जाता है। इन gnotobiotic कीड़ों में उनके खड़ी संचारित ब्लैटबैक्टीरियम एंडोसिम्बियन होते हैं लेकिन एक्सोनिक हिम्मत होती है।
Gnotobiotic तिलचट्टा पीढ़ी प्रोटोकॉल देशी आंत माइक्रोबियल समुदाय को हटाने और मेजबान स्वास्थ्य और माइक्रोबायोम विधानसभा पर प्रतिस्थापन के प्रभाव के परीक्षण की सुविधा । यह तकनीक महंगी विशेषता प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग के बिना जनोटोबायोटिक तिलचट्टे पैदा करने के लिए एक एकजुट, सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह बनाने के लिए कई स्रोतों से विधियों का उपयोग करती है। इस gnotobiotic प्रोटोकॉल के कई अलग-अलग चलती भागों को ध्यान में रखते हुए, दृश्य शोधकर्ताओं को अधिक आसानी से अपने छोटे पैमाने पर, कम लागत, बेंच-टॉप gnotobiotic सुविधाओं को स्थापित करने में मदद करता है।
नियोजित प्रयोगों के लिए ओथेके ले जाने वाली महिलाओं की उचित संख्या के संग्रह को सुविधाजनक बनाने के लिए, स्टॉक टैंक में ग्रेविड महिलाओं वाले कार्डबोर्ड ट्यूबों को स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। यदि एक कार्डबोर्ड ट्यूब में ग्रेविड मादा के अलावा कई कीड़े होते हैं, तो ट्यूब सामग्री को पेट्रोलियम जेली के साथ बजने वाले एक अतिरिक्त प्लास्टिक कंटेनर में हिलाएं और लक्ष्य कीट को अकेले कार्डबोर्ड ट्यूब में वापस चढ़ने के लिए प्रोत्साहित करें। संग्रह पर, प्रत्येक ग्रेविड मादा को प्रसूति वार्ड में स्थानांतरित करें।
एक बार मादाओं ने अपने ओथेक को गिरा दिया है, तो महिलाओं को स्टॉक टैंक में वापस करें और कूड़े से ओथेक को पुनः प्राप्त करने के लिए संदंश का उपयोग करें। ओथेके को साफ करने के लिए, पांच मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में पांच अंडे के मामलों को रखें जिसमें सोडियम डोडेसिल सल्फेट के तीन मिलीलीटर होते हैं और 10 सेकंड के लिए ओथेकै को भंवर देते हैं। एक दूसरे धोने के बाद के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया, एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करने के लिए धीरे प्रत्येक ootheca की सतह साफ़ करने के लिए किसी भी मलबे को दूर करने और एक वजन नाव में साफ ootheca जगह है ।
नसबंदी से पहले, प्रति ट्यूब दो 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब को प्रति ट्यूब बाँझ पानी के एक मिलीलीटर के साथ भरें। इसके अलावा एक धुएं हुड में पांच मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में डबल-डिस्टिल्ड पानी के 3.2 मिलीलीटर के लिए 32% पेरासेटिक एसिड स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। कैप और उलटा कई बार मिश्रण करने के लिए और पांच साफ oothecae हौसले से तैयार 0.1% peracetic एसिड समाधान में पांच मिनट के लिए जगह है, ट्यूब उलटा कई बार हर 60 सेकंड.
पेरासेटिक एसिड एक मजबूत ऑक्सीडाइजर एक आंख, त्वचा, और श्वसन अड़चन है, और ज्वलनशील और संक्षारक है। हमेशा अपने कचरे को संभालने और उचित निपटाने के दौरान उचित पीपीई पहनें। इनक्यूबेशन के अंत में, बाँझ संदंश और एक लैमिनार प्रवाह हुड का उपयोग करने के लिए बाँझ कुल्ला पानी की अपनी अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए प्रत्येक ootheca हस्तांतरण ।
कुल्ला पानी की ट्यूबों के दूसरे सेट के लिए oothecae स्थानांतरित करने से पहले मिश्रण करने के लिए कई बार उलटा। दूसरी कुल्ला के बाद, अलग-अलग बीएचआई स्लेंट में ओथेकै को स्थानांतरित करने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें। एक निष्फल माध्यमिक कंटेनर में slants प्लेस और चार से पांच सप्ताह के लिए एक आर्द्र 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कंटेनर ले जाने के लिए जब तक रची ।
चौथे सप्ताह तक फंगल या बैक्टीरियल ग्रोथ के लिए प्रति सप्ताह नियमित रूप से एक से दो बार स्लेंट की जांच करें, जिस बिंदु पर slants की रोजाना जांच की जानी चाहिए । जब नस्लें निकलना शुरू करती हैं, तो बाँझ संदंश और एक लैमिनार प्रवाह हुड का उपयोग करें ताकि निष्फल चूहा चाउ के एक गोली को तैयार बीएची फ्लास्क में स्थानांतरित किया जा सके। एक बंध्यता की जांच के रूप में, दूषित विकास की कमी की पुष्टि करने के लिए 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में माध्यमिक कंटेनर में फ्लास्क रखें ।
यदि फ्लास्क बाँझ बना हुआ है, तो नस्लों को तिरछा से हिलाएं, जिससे उन्हें लैमिनार प्रवाह हुड में फ्लास्क में गिरने दें। फिर लैमिनार फ्लो हुड में प्रति सप्ताह एक बार बाँझ पानी के 300 माइक्रोलीटर के साथ नस्लों को पानी दें। जब नस्ल मल मध्यम मंजिल को कवर करना शुरू करते हैं, तो नस्लों को एक नए बीएचआई फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें निष्फल चूहा चाउ 24 घंटे पहले जोड़ा गया, जैसा कि प्रदर्शन किया गया था।
गर्भवती महिलाओं को उनके पीछे के पेट से जुड़े ओथेका द्वारा पहचाना जा सकता है। ऊथेके नसबंदी के बाद औसतन 34 दिन होते हैं। असफल नसबंदी के मामलों में, विकास इनक्यूबेशन के दौरान ओथेके के आसपास दिखाई दे सकता है, जो हैचलिंग की जनोटोबायोटिक स्थिति से समझौता करता है।
फिर कीट शरीर की लंबाई को मापकर निम्फल विकास दर को ट्रैक किया जा सकता है। एक समरूप नस्ल से 16S रिबोसोमल डीएनए के प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता का उपयोग gnotobiotic स्थिति की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। गनोओबायोटिक तिलचट्टे को सिंथेटिक या ज़ेनोबायोटिक माइक्रोबियल समुदायों के साथ टीका लगाया जा सकता है।
हालांकि यह विशेष कार्यप्रवाह नया है, लेकिन जनोटोबायोटिक तिलचट्टे का उपयोग करके पिछले अध्ययनों ने सामाजिक व्यवहार, आंत स्वास्थ्य और उनके कीट मेजबानों की प्रतिरक्षा को आकार देने में आंत माइक्रोबायोम असेंबली और माइक्रोबियल भूमिकाओं में अंतर्दृष्टि उत्पन्न की है।
