Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Het protocol aangetoond in deze video stelt ons in staat om de rol van darmmetabolieten op schimmelhyphal hyphal morfogenese te begrijpen. Deze ex vivo techniek min of meer de dichtstbijzijnde benadering van de darm voor het bestuderen van schimmel hyphal morfogenese op een manier die geen in vitro studie kan repliceren. Deze methode kan worden toegepast om de rol van darmmetabolieten op andere enterische pathogenen te bestuderen.

Ontleden muizen met behulp van autoclaved gesteriliseerde scherp-ended schaar en tangen. Na euthanasie, zet het dier vast aan een dissectieoppervlak door alle ledematen vast te pinnen om de buik bloot te stellen. Spray de buikstreek met 70% ethanol om te voorkomen dat bont vastkleeft aan tangen, scharen of darmsecties.

Gebruik tangen te knijpen en til een deel van de huid aan de basis van de buik en maak een kleine incisie door de huid en de onderliggende fascia verzorgen om te voorkomen dat puncturing de cecum of darmwand. Breid deze snede uit tot de ribbenkast en stel de buikholte gedeeltelijk bloot en maak vervolgens een snede vanaf het punt van de initiële incisie aan weerszijden en strekt zich uit naar boven en zijdelings. Trek deze flappen zijdelings en pin ze aan het ontledende oppervlak om de buikholte volledig bloot te leggen.

Haal het GI-darmkanaal met tangen eruit terwijl je een schaar gebruikt om snijwonden superieur te maken aan de maag en in het distale gebied van de dikke darm om de grootste hoeveelheid darminhoud te verzamelen. Let er bij het verwijderen van het GI-kanaal op dat de afzonderlijke componenten niet meer worden gescheurd. Scheid de maag, dunne darm, cecum, en dikke darm op hun proximale en distale uiteinden.

Voor het verzamelen van darminhoud van elke sectie, maak een enkele incisie aan het distale uiteinde, dan handmatig verdrijven de darminhoud in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met tangen. Bewaar de monsters op min 80 graden Celsius voor ex vivo tests. Streep een frisse cultuur van C.albicans SC5314 op een YPD agar plaat en broed het ‘s nachts op 30 graden Celsius.

Op de volgende dag, kies twee of drie middelgrote individuele kolonies en resuspend ze in een milliliter pbs. Haal bevroren darminhoud uit de vriezer en ontdooi ze op 25 graden Celsius. Breng ongeveer 150 milligram darminhoud over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en zet ze opnieuw op met 150 microliter PBS.

Vortex het monster op hoge snelheid gedurende 30 seconden om de darminhoud te homogeniseren en laat het zitten op kamertemperatuur voor ongeveer een minuut. Centrifugeer de homogenaten op 1.000 keer G gedurende drie minuten, dan de overdracht van de supernatant naar een nieuwe 1,5 milliliter buis die ervoor zorgt dat geen puin over te dragen. Voeg na het herhalen van de centrifugatie 10 microliter van het C.albicans-inoculum toe aan het supernatant, meng goed en broed het monster vier tot vijf uur in op 37 graden Celsius.

Om het effect van exogene metabolieten op C.albicans te testen, voeg de gewenste concentratie metabolieten toe aan het darmgehalte en het PBS-mengsel, draai je het monster vervolgens 30 seconden op hoge snelheid, laat het 10 minuten op kamertemperatuur zitten en voer centrifugatie en inenting uit zoals eerder beschreven. Centrifuge de schimmelcelcultuur op 1.000 keer G gedurende twee minuten en gooi de supernatant weg. Bevestig de monsters in 100 microliter van 2%PFA gedurende 15 minuten, herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.

Was de monsters twee maal met een milliliter PBS volgens de handschriftaanwijzing en broed de monsters vervolgens bij kamertemperatuur in 100 microliter pbs met polyklonal c.albicans antilichaam gedurende 30 minuten. Na de incubatie was je het monster nog drie keer met PBS, werkend bij weinig licht om fotobleaching te voorkomen. In een donkere kamer, incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in 100 microliter van PBS met anti-konijn IgG Alexa Fluor 488 antilichaam bij een een tot 500 verdunning.

Na het wassen van het monster drie keer met een milliliter PBS, resuspend het in 100 microliter van PBS en breng het naar een 96-well plaat voor beeldvorming. Beeld de schimmelcellen met een fluorescentie beeldmicroscoop met behulp van 20X en 40X objectieve lenzen en een groene fluorescerende eiwitfilter. Wanneer C.albicans wordt geteeld ex vivo in gut homogenaat extracten uit de maag, dunne darmen en dikke darmen van onbehandelde controle en antibiotica behandelde muizen, het ontwikkelt zich over het algemeen met een gist morfologie.

Echter, wanneer geteeld in de cecal extract van met antibiotica behandelde muizen, C.albicans gemakkelijk ondergaat morfogenese wat resulteert in gist en hyphae vormen. Dit geeft aan dat behandeling met antibiotica veranderingen in de cecal omgeving veroorzaakt, die hyphal morfogenese van C.Albicans induceren. Exogene toevoeging van glucose aan het cecal homogenaat van met antibiotica behandelde muizen toonde een enorme hyphal ontwikkeling ex vivo.

Deze resultaten suggereren dat toevoeging van darmmetabolieten terug naar het cecal homogenaat van de met antibiotica behandelde muizen de morfogenese van C.albicans differentieel reguleert. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat optimalisatie van de verdunning van het darmgehalte zorgt voor voldoende inzameling van darmmetabolieten zonder inzameling van puin. Niet meer dan een twee-op-een media-tot-darmgehalte verdunning en streven naar een lagere verdunning indien mogelijk.

Deze techniek wordt nu gebruikt om te onderzoeken hoe specifieke metabolieten in de darm impact hyphal ontwikkeling, waardoor onderzoekers beter te begrijpen van de rol van darmmetabolieten op schimmel pathogenese.