En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Protokollen demonstrert i denne videoen tillater oss å forstå rollen som tarm metabolitter på sopp bindestrek morfogenese. Denne ex vivo teknikken mer eller mindre den nærmeste tilnærming av tarmen for å studere sopp bindestrek morfogene på en måte som ingen in vitro studie kan replikere. Denne metoden kan brukes til å studere rollen som tarmmetabolitter på andre enteriske patogener.

Dissekere mus ved hjelp av autoklavert sterilisert skarp-end saks og tang. Etter eutanasi, fest dyret til en disseksjonsoverflate ved å feste alle lemmer for å eksponere magen. Spray bukregionen med 70% etanol for å hindre pels fra å holde seg til tang, saks eller tarmseksjoner.

Bruk tang til å klemme og løfte en del av huden ved foten av magen og skape et lite snitt gjennom huden og underliggende fascia tar vare for å unngå punktering av cecum eller tarmveggen. Utvid dette kuttet til brystkassen delvis utsette peritoneal hulrom, deretter gjøre et kutt starter på punktet av det første snittet på hver side og strekker seg oppover og lateralt. Trekk disse klaffene sidealt og fest dem til disseksjonsoverflaten for å fullstendig eksponere bukhulen.

Trekk ut GI-kanalen med tang mens du bruker saks for å gjøre kutt bedre enn magen og i den distale delen av tykktarmen for å sikre innsamling av størst mengde tarminnhold. Når du fjerner GI-kanalen, må du være forsiktig for å unngå rupturing av de enkelte komponentene. Skill mage, tynntarm, cecum og tykktarmen i deres proksimale og distale ender.

For innsamling av tarminnhold fra hver seksjon, gjør et enkelt snitt på den distale enden, og fjern deretter tarminnholdet manuelt til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør med tang. Oppbevar prøvene ved minus 80 grader Celsius for ex vivo-analyser. Strek en frisk kultur av C.albicans SC5314 på en YPD agar plate og inkubere den over natten på 30 grader Celsius.

På neste dag velger du to eller tre mellomstore individuelle kolonier og bruker dem på nytt i ett milliliter PBS. Hent frossen tarminnhold fra fryseren og tin dem ved 25 grader Celsius. Overfør ca. 150 milligram tarminnhold til et nytt 1,5 milliliter rør og gjenoppliv dem med 150 mikroliter PBS.

Vortex prøven ved høy hastighet i 30 sekunder for å homogenisere tarminnholdet og la den sitte ved romtemperatur i omtrent et minutt. Sentrifuge homogenatene ved 1000 ganger G i tre minutter, og overfør deretter supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør som tar vare på å ikke overføre rusk. Etter å ha gjentatt sentrifugeringen, tilsett 10 mikroliter av C.albicans inokuleum til det supernatante, bland godt og inkuber prøven ved 37 grader Celsius i fire til fem timer.

For å teste effekten av eksogene metabolitter på C.albicans, tilsett ønsket konsentrasjon av metabolitter til tarminnholdet og PBS-blandingen, og virvle deretter prøven ved høy hastighet i 30 sekunder, la den sitte ved romtemperatur i 10 minutter, og utfør sentrifugering og inokulasjon som tidligere beskrevet. Sentrifuger soppcellekulturen ved 1000 ganger G i to minutter og kast supernatanten. Fiks prøvene i 100 mikroliter på 2% PFA i 15 minutter, gjenta deretter sentrifugeringen og kast supernatanten.

Vask prøvene to ganger med en milliliter PBS i henhold til manuskriptretninger, og inkuber deretter prøvene ved romtemperatur i 100 mikroliter PBS med polyklonale C.albicans antistoff i 30 minutter. Etter inkubasjonen vasker du prøven tre ganger til med PBS, arbeider i svakt lys for å unngå fotografering. I et mørkt rom inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 minutter i 100 mikroliter PBS som inneholder antikanin IgG Alexa Fluor 488 antistoff ved en 1 til 500 fortynning.

Etter å ha vasket prøven tre ganger med en milliliter PBS, gjenbruker du den i 100 mikroliter PBS og overfører den til en 96-brønns plate for bildebehandling. Bilde soppcellene med fluorescensavbildningsmikroskop ved hjelp av 20X og 40X objektive linser og et grønt fluorescerende proteinfilter. Når C.albicans dyrkes ex vivo i tarm homogenate ekstrakter tatt fra magen, tynntarmen og tykktarmen av ubehandlet kontroll og antibiotikabehandlede mus, utvikler det seg vanligvis med en gjærmorfologi.

Men når dyrket i cecal ekstrakt fra antibiotikabehandlede mus, gjennomgår C.albicans lett morfogenese som resulterer i gjær og hyphaeformer. Dette indikerer at antibiotikabehandling forårsaker endringer i cecal miljøet, som induserer bindestrekmorfogenese av C.Albicans. Eksogene tillegg av glukose til cecal homogenate av antibiotikabehandlede mus viste en massiv bindestrek utvikling ex vivo.

Disse resultatene tyder på at tilsetning av tarmmetabolitter tilbake til cecal homogenate av antibiotika-behandlet mus differensial regulerer morfogenesen av C.albicans. Når du prøver denne protokollen, Husk at optimalisering av fortynning av tarminnholdet sikrer tilstrekkelig innsamling av tarmmetabolitter uten innsamling av rusk. Ikke overskrid en to-til-en media-til-tarm-innholdsfortynning og sikt på en lavere fortynning hvis mulig.

Denne teknikken brukes nå til å utforske hvordan spesifikke metabolitter i tarmpåvirkningsstreken, slik at forskerne bedre kan forstå rollen som tarmmetabolitter på sopppatogenese.