Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель
Chapters
Summary January 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы разработали обобщенный протокол для диссоциативного большого количества высококачественных одиночных клеток из эпителия и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных и взрослых мышей.
Transcript
Высокий выход и качество клеток из сложных тканей имеют важное значение для широко используемого экспериментального анализа, такого как секвенирование РНК одной клетки и первичные культуры стволовых клеток. Этот протокол генерирует здоровые клетки с высоким выходом и качеством из различных областей и тканевых компартментов языка млекопитающих, включая эпителий языка и соединительную ткань. Чтобы отделить эпителий от мезенхимы языка мыши E 12.5, перенесите усыпленную беременную самку мыши в хирургическую область и смочите брюшную полость мыши 70% этанолом, чтобы предотвратить попадание меха в место операции.
Откройте брюшную полость с помощью рассекающих ножниц, чтобы обнажить матоточные рога, несущие эмбрионы, рассеките рога матки и перенесите их на 15 миллилитров свежего раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивирования. Под рассекающим микроскопом используйте мини-ножницы и тонкие щипцы, чтобы рассекать эмбрионы от рогов матки. Откройте полость рта тонкими щипцами и рассекайте язык от мандиблы с помощью мини-ножниц.
Промыть языки 15 миллилитрами свежего стерильного раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивовки. Затем переложите ткани на два миллилитра ферментной смеси диспазы и коллагена в 35-миллиметровую культурную чашку и инкубируют в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Перенесите языки на 15 миллилитров свежего стерильного раствора Тирода и аккуратно отделите мезенхиму и эпителий с вентральной стороны с помощью тонких щипцов.
Отделенная эпителия и мезенхима промыть дважды в 15 миллилитрах свежего стерильного раствора Тирода. Чтобы отделить эпителий языка от подлежащей соединительной ткани взрослой мыши, перенесите усыпленную мышь в хирургическую область и смочите голову мыши, используя 70% этанол, чтобы предотвратить попадание меха в ротовую полость. Используйте рассекающие ножницы, чтобы срезать уголки рта вдоль щеки, чтобы открыть ротовую полость.
Рассекните язык с помощью мандиблы, вымойте его и поместите в пластиковую посуду со слоем полиэтиленовой пленки. Используя хирургические щипцы для удержания языка, вводят ферментную смесь диспазы и коллагеназы в субэпителиальное пространство языка через режущий край заднего языка. Вводят один миллилитр ферментной смеси равномерно на весь язык для сбора тканей, затем вводят 0,5 миллилитра ферментной смеси локально в передний язык для сбора тканей с кончика языка или на задний язык для циркумвалляционного сбора ткани сосочков.
Оберните язык полиэтиленовой пленкой и высиживая его в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Используйте мини-ножницы, чтобы рассекать циркумваллатный сосочек и кончик языка. Затем переложить ткань на 15 миллилитров свежего стерильного раствора Тирода.
Отделите эпителий от подлежащей соединительной ткани в ферменте, перевариваемом субэпителиальном пространстве, используя мини-ножницы, и обрежьте ткани до надлежащего размера, в соответствии с требованием последующих экспериментов. Дважды промыть отделенный эпителий и подлежащую соединительную ткань в 15 миллилитрах свежего стерильного раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивирование. Переложите ткани на три миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА в новой 35-миллиметровой чашке для культивирование.
Инкубируйте блюдо в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, осторожно перемешивая ткани каждые пять минут одним миллилитром наконечников пипетки. Добавьте 500 микролитров 5% FBS в DMEM F12, чтобы остановить реакцию и перенести среду в пятимиллилитровую центрифужную трубку с низким связыванием. Центрифугируют клеточную суспензию в 200 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре и удаляют супернатант.
Осторожно повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах DMEM F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, и фильтруйте клетки с помощью 70-микрометрового клеточного сетчатого фильтра, за которым следует 35-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. Центрифугируют клеточную суспензию в 200 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре, затем удаляют большую часть среды, оставляя от 50 до 300 микролитров в качестве конечного объема для повторного суспендирования клеток. В эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов.
На язык взрослой мыши успешная инъекция фермента указывает на отек в вводимых областях, что говорит о том, что фермент может удерживаться языком. После объединения эпителиальных листов языка E12.5 и тонких слоев мезенхимы ручной подсчет клеток показал, что протокол дал 63 917 клеток в общей сложности с жизнеспособностью 95,2% из эпителиальных листов и 294 333 клетки в общей сложности с жизнеспособностью 96,3% из мезенхимы. Когда использовались 10 взрослых языков в возрасте восьми недель, протокол дал 187 333 клетки с жизнеспособностью 95,4% из эпителиальных листов кончика языка, 544 000 клеток с жизнеспособностью 96,3% из эпителиальных листов циркумваллатных сосочков и 150 500 клеток с жизнеспособностью 93% из соединительных тканей.
Следуя этому протоколу, диссоциированные клетки могут быть использованы для секвенирования одноклеточной РНК и 3D-теста органоидной культуры для определения нераспознанных тестовых клеток-прогениторов под лингвальным эпителием.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
