Developmental Biology
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Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen
Chapters
Summary January 21st, 2021
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Wir haben ein verallgemeinertes Protokoll entwickelt, um eine große Menge hochwertiger Einzelzellen aus dem Epithel und Mesenchym/Bindegewebe embryonaler und erwachsener Mauszungen zu dissoziieren.
Transcript
Hohe Ausbeute und Qualität von Zellen aus komplexen Geweben sind für häufig verwendete experimentelle Analysen wie Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Stammzellkulturen unerlässlich. Dieses Protokoll erzeugt gesunde Zellen mit hoher Ausbeute und Qualität aus verschiedenen Regionen und Gewebekompartimenten der Säugetierzunge, einschließlich Zungenepithel und Bindegewebe. Um das Epithel vom Mesenchym einer E 12.5-Mauszunge zu trennen, übertragen Sie die eingeschläferte schwangere Weibliche in den Operationsbereich und benetzen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell in die Operationsstelle gelangt.
Öffnen Sie den Bauch mit einer Schere, um die Uterushörner freizulegen, die die Embryonen tragen, sezieren Sie die Uterushörner und übertragen Sie sie in eine 15 Milliliter frische Tyrode-Lösung in einer 100-Millimeter-Kulturschale. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Minischere und eine feine Zette, um die Embryonen aus den Uterushörnern zu sezieren. Öffnen Sie die Mundhöhle mit der feinen Zinnen und sezieren Sie mit einer Minischere die Zunge vom Unterkiefer.
Waschen Sie die Zungen mit 15 Millilitern frischer steriler Tyrode-Lösung in einer 100-Millimeter-Kulturschale. Dann das Gewebe in zwei Milliliter einer Enzymmischung aus Dispase und Kollagen in einer 35-Millimeter-Kulturschale auf zwei Milliliter übertragen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zungen auf 15 Milliliter frische sterile Tyrode-Lösung geben und das Mesenchym und das Epithel mit einer feinen Zette vorsichtig von der ventralen Seite trennen.
Waschen Sie die getrennten Epithelien und Mesenchyme zweimal in 15 Millilitern frischer steriler Tyrode-Lösung. Um das Zungenepithel vom darunter liegenden Bindegewebe einer erwachsenen Maus zu trennen, übertragen Sie die eingeschläferte Maus in den Operationsbereich und benetzen Sie den Mauskopf mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell in die Mundhöhle gelangt. Verwenden Sie eine Sezierenschne, um die Mundwinkel entlang der Wange zu schneiden, um die Mundhöhle zu öffnen.
Sezieren Sie die Zunge mit einem Unterkiefer, waschen Sie sie und legen Sie sie in eine Plastikschale mit einer Schicht Plastikfolie. Mit einer chirurgischen Zette, um die Zunge zu halten, injizieren Sie die Enzymmischung aus Dispase und Kollagenase in den subepithelialen Raum der Zunge durch die Schneide der hinteren Zunge. Injizieren Sie einen Milliliter Enzymmischung gleichmäßig auf die gesamte Zunge zur Gewebeentnahme und injizieren Sie dann 0,5 Milliliter Enzymmischung lokal auf die vordere Zunge zur Gewebeentnahme von der Zungenspitze oder auf die hintere Zunge zur Entnahme von zirkumvallatem Papillengewebe.
Wickeln Sie die Zunge mit Plastikfolie ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Mini-Schere, um die umlaufende Papille und die Zungenspitze zu sezieren. Dann ein Gewebe auf 15 Milliliter frische sterile Tyrode-Lösung übertragen.
Trennen Sie das Epithel mit einer Minischere vom darunter liegenden Bindegewebe im enzymverdauten Subepithelraum und trimmen Sie das Gewebe entsprechend den Anforderungen nachgeschalteter Experimente auf eine angemessene Größe. Waschen Sie das abgetrennte Epithel und das darunter liegende Bindegewebe zweimal in 15 Millilitern frischer steriler Tyrode-Lösung in einer 100-Millimeter-Kulturschale. Übertragen Sie das Gewebe auf drei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in einer neuen 35-Millimeter-Kulturschale.
30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und das Gewebe alle fünf Minuten mit einem Milliliter Pipettenspitzen sanft aufrühren. Fügen Sie 500 Mikroliter von 5% FBS in DMEM F12 hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und übertragen Sie das Medium in ein fünf Milliliter niedrig bindendes Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
Die Zellen werden vorsichtig in drei Millilitern DMEM F12 mit 10% FBS und 1% BSA resuspendiert und die Zellen mit einem 70 Mikrometer Zellsieb filtriert, gefolgt von einem 35 Mikrometer Zellsieb. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 mal G für acht Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann den größten Teil des Mediums, wobei 50 bis 300 Mikroliter als endgültiges Volumen übrig bleiben, um die Zellen wieder aufzusetzen. In der embryonalen Mauszunge ist nach der richtigen Enzymverdauung eine Lücke im subepithelialen Raum sichtbar.
In der erwachsenen Mauszunge wird eine erfolgreiche Enzyminjektion durch Schwellung in den injizierten Bereichen angezeigt, was darauf hindeutet, dass das Enzym von der Zunge gehalten werden kann. Nach der Bündelung der Epithelblätter von E12,5-Zungen und dünnen Mesenchymschichten zeigte die manuelle Zellzählung, dass das Protokoll insgesamt 63.917 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 95,2% aus den Epithelblättern und 294. 333 Zellen insgesamt mit einer Lebensfähigkeit von 96,3% aus dem Mesenchym ergab. Wenn 10 erwachsene Zungen im Alter von acht Wochen verwendet wurden, ergab das Protokoll 187, 333 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 95,4% aus Epithelblättern der Zungenspitze, 544.000 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 96,3% aus Epithelblättern von Circumvallat-Papillen und 150.500 Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 93% aus Bindegewebe.
Nach diesem Protokoll können die dissoziierten Zellen für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und die 3D-Testorganoidkultur verwendet werden, um nicht erkannte Testvorläuferzellen unter dem Lingualen Epithel zu definieren.
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