Biology
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単一細菌への重水素取り込みの誘導ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験
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Summary February 14th, 2022
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このプロトコルは、D2O代謝の単一細胞刺激ラマン散乱イメージングによる2.5時間以内の迅速な抗菌剤感受性試験(AST)アッセイを提示します。この方法は、尿または全血環境の細菌に適用され、診療所での迅速な単一細胞表現型ASTに変化します。
Transcript
尿や血液中で2.5時間以内に迅速な抗菌薬感受性試験が可能となり、従来のブロス微量希釈法と比較して分析時間が大幅に短縮できると考えられます。全血などの複雑な環境で細菌の代謝活動を監視できます。まず、波長600ナノメートルの光度計で光学密度を測定して、サンプルから細菌濃度を確認します。
ミリリットル当たり10〜第5コロニー形成単位(CFU)の8倍の最終細胞濃度に達するには、重水素を含まない通常のMHB培地を用いて細菌溶液を希釈する。細菌細胞をボルテックスで混合した後、7本の1.5ミリリットルマイクロチューブに300マイクロリットルの細菌溶液のアリコートを、1本の1.5ミリリットルマイクロチューブに600マイクロリットルの細菌溶液のアリコートを除去します。次に、4.8マイクロリットルの抗生物質ストック溶液を600マイクロリットルの細菌溶液を含むマイクロチューブに追加して、ミリリットルあたり8マイクログラムの最終抗生物質濃度を達成します。
抗生物質を含む300マイクロリットルの細菌溶液を抗生物質を含まない細菌溶液の300マイクロリットルのアリコートに加えて、ミリリットルあたり4マイクログラムの最終抗生物質濃度の2倍希釈溶液を達成します。ミリリットル当たり0.25マイクログラムの最低濃度に達するまで、試験抗生物質の2倍連続希釈を繰り返す。最後のマイクロチューブから300マイクロリットルの溶液を廃棄します。
抗生物質を含まない1本のチューブを重水素処理のポジティブコントロールに割り当て、重水素処理のネガティブコントロールに割り当てます。細菌アリコートを抗生物質含有MHB培地と1時間インキュベートします。一方、抗生物質の段階希釈液を、前述と同じ濃度勾配の100%重水素含有MHB培地で調製します。
1時間のインキュベーション後、100%重水素含有MHB培地で段階希釈した700マイクロリットルの抗生物質を、同じ抗生物質濃度の抗生物質前処理細菌300マイクロリットルに加えます。上下に数回ピペッティングして混合物を均質化します。陽性対照として、抗生物質を含まない100%重水素含有MHB培地700マイクロリットルを抗生物質を含まない細菌300マイクロリットルに加えます。
陰性対照として、抗生物質を含まない0%重水素含有MHB培地700マイクロリットルを抗生物質を含まない細菌300マイクロリットルに追加します。すべてのマイクロチューブを摂氏37度、毎分200回転で30分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルの抗生物質および重水素処理された細菌サンプルを6、200倍gで摂氏4度で5分間遠心分離する。
次に、ペレットを精製水で2回洗浄します。サンプルを10%体積体積ホルマリン溶液に固定し、摂氏4度で保存します。新たに調製した細菌試料から大腸菌濃度を600ナノメートルの波長で光度計で光学濃度を測定して確認する。
臨床尿路感染症サンプルを模倣するには、大腸菌サンプルを10ミリリットルの匿名化された尿サンプルにスパイクして、ミリリットルあたり10〜6CFUの最終濃度に到達します。5ミクロンのフィルターを使用して大腸菌添加尿をろ過し、ろ過した細菌溶液を300マイクロリットルのアリコートで7本の1.5ミリリットルマイクロチューブに分け、600マイクロリットルのアリコートを1本の1.5ミリリットルのマイクロチューブに分割します。前述のように抗生物質の存在下で重水素混入処理を行う。
臨床血流感染サンプルを模倣するために、1ミリリットルの匿名化されたヒト血液中の緑膿菌をスパイクして、1ミリリットルあたり10〜6番目のCFUの最終濃度に到達します。血液を溶解するには、9ミリリットルの滅菌精製水を加えます。緑膿菌のスパイク血液を5ミクロンのフィルターでろ過します。
次に、摂氏4度で5分間6、200倍gで遠心分離することにより、ろ過したサンプルから1ミリリットルの容量まで細菌を回収します。遠心分離後、緑膿菌添加血液溶液を300マイクロリットルアリコートで1.5ミリリットルマイクロチューブ7本、1.5ミリリットルマイクロチューブ1本に菌液600マイクロコートに分け、前述のように抗生物質の存在下で重水素混入処理を行います。サンプル調製のために、1ミリリットルの固定菌液を精製水で洗浄し、洗浄した菌液を6、200倍gで4°Cで5分間遠心分離する。
上清を取り除き、滅菌水で細菌溶液を約20マイクロリットルに濃縮します。ポリ-L-リジンコーティングされたカバーガラスに細菌溶液を堆積させ、別のカバーガラスでサンドイッチし、サンプルを密封します。SRS顕微鏡では、繰り返し速度が80メガヘルツの調整可能なフェムト秒レーザーがポンプとストークス励起レーザーを提供します。
ストークスビームは、2.4メガヘルツの音響光変調器によって変調されます。2つのビームは、ダイクロイックミラーを介してコリナーリーに結合されます。次に、ポンプとストークスのビームは、レーザースキャン用の2Dガルボミラーを備えたラボ製のレーザー走査型顕微鏡に送られます。
60倍の水対物レンズがレーザーをサンプルに集束させ、オイルコンデンサーがサンプルからの信号を収集します。2つのフィルタを使用してストークスビームをフィルタで除去し、ポンプビームをフォトダイオードで検出した後、誘導ラマン信号をロックインアンプで抽出します。制御ソフトウェアを使用して、ポンプ波長を852ナノメートルに入力および調整します。
C to Dの振動周波数を2, 168波数に調整して、SRS顕微鏡を使用して細菌を画像化します。パワーメーターを使用してレーザー出力を測定します。レーザー出力の前にある半波長板を調整して、サンプルでのポンプレーザーの出力を8ミリワットに設定し、サンプルでのストークスレーザーの出力を50ミリワットに設定します。
標準サンプルDMSO d6をサンプルステージに置き、60倍の水浸対物レンズを使用して、ポンプとストークスレーザーをサンプルに集中させます。反射ミラーのネジを調整することにより、ポンプとストークスビームを空間的に位置合わせし、2つのビームをレーザースキャン用の2Dガルボミラーシステムを備えた直立顕微鏡に向けます。ソフトウェアのコントロールパネルで、各SRSイメージを200 x 200ピクセル、ピクセル滞留時間を30マイクロ秒に設定します。
1枚の画像の合計取得時間は約1.2秒です。ステップサイズを150ナノメートルに設定すると、画像サイズは約30 x 30マイクロメートルの正方形になります。システムを最適化した後、標準サンプルを取り出し、細菌サンプルを60倍の水浸対物レンズの下のサンプルステージに置きます。
細菌サンプルのSRSイメージングを開始します。各サンプルについて少なくとも3つの視野を画像化する。重水素の取り込みに対するインキュベーション時間の影響は、CDおよびCH領域での自発的ラマン顕微分光法によって測定されます。
単一細菌の重水素インキュベーション時間にわたるCD対CH強度比プロットは、0から180分のインキュベーション時間にわたってCD対CH強度の増加を示した。緑膿菌のSRSイメージングは、ゲンタマイシンおよび70%重水素とのインキュベーション時に実施されました。.さらなる定量的統計分析は、細菌のCDシグナルが、ゲンタマイシン処理なしよりもミリリットルあたり2マイクログラム、またはより高いゲンタマイシン濃度で有意に低いことを示しました。
0.60のカットオフ強度閾値は、緑膿菌がミリリットルあたり2マイクログラムおよび高濃度のゲンタマイシンで代謝的に阻害されたと結論付けました。.正常MHB培地中のゲンタマイシンに対する緑膿菌のSC-MICは1ミリリットルあたり2マイクログラムと決定され、ブロス微量希釈法で決定されたMICとは1ミリリットルあたり4マイクログラムの1倍の差の範囲内でした。大腸菌添加尿サンプルの迅速抗菌剤感受性試験(AST)は、SRSイメージングによって実施されました。
アモキシシリンに対する大腸菌添加尿検体のSC-MICは4マイクログラム/ミリリットルと判定され,通常のMHB培地中の純大腸菌の従来のブロス希釈法によるMIC8マイクログラム/ミリリットルと同等の感受性読み出しとなった。ヒト血液中にスパイクした緑膿菌の迅速ASTの適用性をSRSイメージングにより検討した。2, 168センチメートルでのSRS画像のCD強度は、生細菌の代謝重水素取り込みに由来する細菌シグナルによって支配されていました。
血中緑膿菌のSC-MICはミリリットルあたり2マイクログラムと判定され,正常増殖培地中の緑膿菌の従来の標準MIC結果とよく一致した。抗菌剤感受性試験に使用される細菌細胞数は、臨床検査基準研究所が推奨するように、ミリリットルあたり10〜5コロニー形成単位の約5倍に保たれます。細菌濃度が高いほど、最小阻害濃度が上昇する可能性があります。
in situ病原体の同定と迅速な抗菌薬感受性試験診断を組み合わせることで、正確な治療のための適切な抗菌剤を時間通りに特定できるクリニックへの変換に大きな可能性があります。
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