Rask antimikrobiell følsomhetstesting ved stimulert Raman-spredningsavbildning av Deuterium-inkorporering i en enkelt bakterie

Rask antimikrobiell følsomhetstesting kan oppnås innen 2,5 timer i urin og blod, noe som regnes som en enorm reduksjon i analysetid sammenlignet med den konvensjonelle buljongmikrofortynningsmetoden. Det kan overvåke bakteriell metabolsk aktivitet i et komplekst miljø, for eksempel fullblod. For å begynne, kontroller bakteriekonsentrasjonen fra prøvene ved å måle den optiske tettheten med et fotometer ved 600 nanometer bølgelengde.

For å nå en endelig cellekonsentrasjon på åtte ganger 10 til de femte kolonidannende enhetene, eller CFU, per milliliter, fortynn bakterieoppløsningen ved å bruke det normale MHB-mediet uten deuterium. Etter å ha blandet bakteriecellene med virvel, fjern 300 mikroliter aliquots av bakterieoppløsningen i syv 1, 5 milliliter mikrorør og en 600 mikroliter aliquot av bakterieoppløsningen i en 1, 5 milliliter mikrotube. Tilsett deretter 4,8 mikroliter av antibiotikablandingen i mikrorøret som inneholder 600 mikroliter av bakterieoppløsningen for å oppnå den endelige antibiotikakonsentrasjonen på åtte mikrogram per milliliter.

Tilsett 300 mikroliter av bakterieoppløsningen med antibiotika til en 300 mikroliter aliquot av bakterieoppløsningen uten antibiotika for å oppnå en todelt fortynnet løsning med den endelige antibiotiske konsentrasjonen på fire mikrogram per milliliter. Gjenta den todelte serielle fortynningen av testantibiotika til den laveste konsentrasjonen på 0, 25 mikrogram per milliliter er nådd. Kast 300 mikroliter av løsningen fra det siste mikrorøret.

Tildel ett rør uten antibiotika til den positive kontrollen med deuteriumbehandling, og den negative kontrollen uten deuterium. Inkuber bakteriell aliquot med antibiotikumet som inneholder MHB-medium i en time. I mellomtiden forbereder du en seriell fortynning av antibiotika med 100% deuteriumholdig MHB-medium med samme konsentrasjonsgradienter som beskrevet tidligere.

Etter en times inkubasjon, tilsett 700 mikroliter antibiotika serielt fortynnet med 100% deuteriumholdig MHB-medium til 300 mikroliter antibiotika forbehandlede bakterier i samme antibiotikakonsentrasjon. Homogeniser blandingen ved pipettering opp og ned flere ganger. Tilsett 700 mikroliter antibiotikafri 100% deuterium som inneholder MHB-medium til 300 mikroliter antibiotikafrie bakterier som en positiv kontroll.

Tilsett 700 mikroliter antibiotikafritt 0% deuterium som inneholder MHB-medium til 300 mikroliter antibiotikafrie bakterier som en negativ kontroll. Inkuber alle mikrorørene ved 37 grader Celsius og 200 rotasjoner per minutt i 30 minutter. Etter inkubering, sentrifuger en milliliter antibiotika og deuteriumbehandlet bakterieprøve ved 6.200 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius.

Vask deretter pelleten to ganger med renset vann. Fest prøvene i 10% volum for volum formalinløsning, og lagre dem ved fire grader Celsius. Kontroller Escherichia coli-konsentrasjonen fra den nytilberedte bakterieprøven ved å måle den optiske tettheten med et fotometer ved 600 nanometer bølgelengde.

For å etterligne de kliniske urinveisinfeksjonsprøvene, spike Escherichia coli-prøven i 10 milliliter avidentifiserte urinprøver for å nå en endelig konsentrasjon på 10 til de seks CFU per milliliter. Filtrer Escherichia coli spiked urin ved hjelp av et fem mikron filter, og del den filtrerte bakterielle løsningen i 300 mikroliter aliquots i syv 1, 5 milliliter mikrorør og en 600 mikroliter aliquot i en 1, 5 milliliter mikrotube. Utfør deuterium inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika som beskrevet tidligere.

For å etterligne de kliniske blodbaneinfeksjonsprøvene, spike Pseudomonas aeruginosa i en milliliter avidentifisert humant blod for å nå en endelig konsentrasjon på 10 til den sjette CFU per milliliter. For å lyse blodet, tilsett ni milliliter sterilt renset vann. Filtrer Pseudomonas aeruginosa spiked blod ved hjelp av et fem mikron filter.

Høst deretter bakterier fra den filtrerte prøven til et milliliter volum ved sentrifugering ved 6.200 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, del Pseudomonas aeruginosa spiked blodløsning i 300 mikroliter aliquots i syv 1, 5 milliliter mikrorør og en 600 mikroliter aliquot av bakterieoppløsningen i en 1, 5 milliliter mikrotube, og utfør deuterium inkorporeringsbehandling i nærvær av antibiotika som beskrevet tidligere. For prøveprepareringen, vask en milliliter fast bakterieoppløsning med renset vann, og sentrifuger den vasket bakterieoppløsningen ved 6.200 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius.

Fjern supernatanten og berik bakterieoppløsningen til ca. 20 mikroliter med sterilisert vann. Sett bakterieløsningen på et poly-L-lysinbelagt dekselglass, sandwich med et annet dekselglass, og forsegl prøven. I SRS-mikroskopet gir en justerbar femtosekundlaser med en repetisjonshastighet på 80 megahertz pumpen og Stokes eksitasjonslasere.

Stokes-strålen moduleres av en akustooptisk modulator på 2,4 megahertz. De to bjelkene er kolinøst kombinert gjennom et dikroisk speil. Deretter ledes pumpen og Stokes-strålene inn i et laboratoriebygget laserskanningsmikroskop med et 2D Galvo-speil for laserskanning.

Et 60x vannmål fokuserer laserne til prøven, og en oljekondensator samler signalet fra prøven. To filtre brukes til å filtrere ut Stokes-strålen, mens pumpestrålen oppdages av en fotodiode, hvoretter det stimulerte Raman-signalet ekstraheres av en låseforsterker. Bruk kontrollprogramvaren til å legge inn og justere pumpens bølgelengde til 852 nanometer.

Juster C til D vibrasjonsfrekvens til 2, 168 bølgetall for å avbilde bakterier ved hjelp av et SRS-mikroskop. Mål lasereffekten ved hjelp av en effektmåler. Sett kraften til pumpelaseren ved prøven til åtte milliwatt, og kraften til Stokes laser ved prøven til 50 milliwatt ved å justere halvbølgeplaten foran laserutgangen.

Plasser standardprøven DMSO d6 på prøvetrinnet, og bruk et 60x vanndypingsmål for å fokusere pumpen og Stokes-laserne på prøven. Ved å justere skruene på refleksjonsspeilene, juster pumpen og Stokes-strålene romlig og rett de to strålene inn i et oppreist mikroskop utstyrt med 2D Galvo-speilsystem for laserskanning. I programvarekontrollpanelet setter du hvert SRS-bilde til å inneholde 200 x 200 piksler og pikseloppholdstiden til 30 mikrosekunder.

Den totale innsamlingstiden for ett bilde er rundt 1,2 sekunder. Sett trinnstørrelsen til 150 nanometer, slik at bildestørrelsen er omtrent 30 x 30 mikrometer kvadrat. Etter å ha optimalisert systemet, ta standardprøven ut og legg bakterieprøven på prøvetrinnet under 60x vannnedsenkingsmålet.

Start SRS-avbildningen av bakterieprøver. Bilde minst tre synsfelt for hvert eksempel. Effekten av inkubasjonstid på deuteriuminkorporering måles ved spontan Raman-mikroskopi ved CD- og CH-regionene.

CD over CH-intensitetsforholdsplottet over deuteriuminkubasjonstid for enkeltbakterier viste økende CD over CH-intensitet over inkubasjonstid fra null til 180 minutter. SRS-avbildning av Pseudomonas aeruginosa ble utført ved inkubasjon med gentamicin og 70 % deuterium. Den videre kvantitative statistiske analysen viste at CD-signaler fra bakterier var signifikant lavere ved to mikrogram per milliliter, eller høyere gentamicinkonsentrasjon enn uten gentamicinbehandling.

Grenseintensitetsgrensen på 0,60 konkluderte med at Pseudomonas aeruginosa ble metabolsk hemmet ved to mikrogram per milliliter og høyere konsentrasjoner av gentamicin. SC-MIC for Pseudomonas aeruginosa mot gentamicin i et normalt MHB-medium ble bestemt til å være to mikrogram per milliliter, som var innenfor en gangs forskjellsområde med MIC på fire mikrogram per milliliter bestemt av buljongmikrodilusjonsmetoden. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing, eller ASAT, av Escherichia coli spiked urinprøver ble utført av SRS imaging.

SC-MIC for Escherichia coli spiked urinprøve mot amoksicillin ble bestemt til å være fire mikrogram per milliliter, som har samme følsomhetsavlesning som MIC på åtte mikrogram per milliliter ved konvensjonell buljongfortynningsmetode for ren Escherichia coli i normalt MHB-medium. Anvendelsen av rask ASAT av Pseudomonas aeruginosa pigget i humant blod ble undersøkt ved SRS-avbildning. CD-intensiteten til SRS-bildet ved 2.168 per centimeter ble dominert av bakterielle signaler som stammer fra metabolsk deuteriuminkorporering av levende bakterier.

SC-MIC for Pseudomonas aeruginosa i blod ble bestemt til å være to mikrogram per milliliter, noe som stemte godt overens med det konvensjonelle standard MIC-resultatet for Pseudomonas aeruginosa i det normale vekstmediet. Bakteriecellenummeret som brukes til antimikrobiell følsomhetstesting, holdes på omtrent fem ganger 10 til de femte kolonidannende enhetene per milliliter, som anbefalt av Clinical and Laboratory Standards Institute. Høyere bakteriekonsentrasjon kan føre til en økning i den minimale hemmende konsentrasjonen.

Kombinering in situ patogenidentifikasjon og rask antimikrobiell følsomhetstesting diagnose kan være av stort potensial for oversettelse til en klinikk som gjør det mulig å identifisere passende antimikrobielle midler i tide for presis behandling.