Snabb testning av antimikrobiell mottaglighet genom stimulerad Raman-spridningsavbildning av deuteriuminkorporering i en enda bakterie

Snabb antimikrobiell känslighetstestning kan erhållas inom 2,5 timmar i urin och blod, vilket anses vara en enorm minskning av analystiden jämfört med den konventionella buljongmikrodilutionsmetoden. Det kan övervaka bakteriell metabolisk aktivitet i en komplex miljö, såsom helblod. För att börja, kontrollera bakteriekoncentrationen från proverna genom att mäta den optiska densiteten med en fotometer vid 600 nanometer våglängd.

För att nå en slutlig cellkoncentration på åtta gånger 10 till de femte kolonibildande enheterna, eller CFU, per milliliter, späd bakterielösningen med det normala MHB-mediet utan deuterium. Efter blandning av bakteriecellerna med virvel, avlägsna 300 mikroliter alikvoter av bakterielösningen i sju 1,5-milliliter mikrorör och en 600 mikroliter alikvot av bakterielösningen i en 1,5-ml mikrotub. Tillsätt sedan 4,8 mikroliter av antibiotikastamlösningen i mikroröret innehållande 600 mikroliter av bakterielösningen för att uppnå den slutliga antibiotikakoncentrationen på åtta mikrogram per milliliter.

Tillsätt 300 mikroliter av bakterielösningen med antibiotikum till en alikvot på 300 mikroliter av bakterielösningen utan antibiotikum för att uppnå en tvåfaldig utspädd lösning med den slutliga antibiotikakoncentrationen på fyra mikrogram per milliliter. Upprepa den tvåfaldiga seriella utspädningen av testantibiotika tills den lägsta koncentrationen på 0,25 mikrogram per milliliter har uppnåtts. Kassera 300 mikroliter av lösningen från det sista mikroröret.

Tilldela ett rör utan antibiotika till den positiva kontrollen med deuteriumbehandling och den negativa kontrollen utan deuterium. Inkubera bakteriella alikvoten med det antibiotikum som innehåller MHB-medium i en timme. Under tiden bereder du en seriell utspädning av antibiotika med 100% deuterium innehållande MHB-medium med samma koncentrationsgradienter som beskrivits tidigare.

Efter en timmes inkubation tillsätt 700 mikroliter antibiotikum seriellt utspätt med 100% deuterium innehållande MHB-medium till 300 mikroliter antibiotika förbehandlade bakterier i samma antibiotikakoncentration. Homogenisera blandningen genom att pipettera upp och ner flera gånger. Tillsätt 700 mikroliter antibiotikafritt 100% deuterium innehållande MHB-medium till 300 mikroliter antibiotikafria bakterier som en positiv kontroll.

Tillsätt 700 mikroliter antibiotikafritt 0% deuterium innehållande MHB-medium till 300 mikroliter antibiotikafria bakterier som en negativ kontroll. Inkubera alla mikrorör vid 37 grader Celsius och 200 rotationer per minut i 30 minuter. Efter inkubation centrifugerar du det en milliliter antibiotika- och deuteriumbehandlade bakterieprovet vid 6 200 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius.

Tvätta sedan pelleten två gånger med renat vatten. Fixa proverna i 10% volym i volym formalinlösning och förvara dem vid fyra grader Celsius. Kontrollera koncentrationen av Escherichia coli från det nyberedda bakterieprovet genom att mäta den optiska densiteten med en fotometer vid 600 nanometers våglängd.

För att efterlikna de kliniska urinvägsinfektionsproverna, spika Escherichia coli-provet i 10 ml avidentifierade urinprover för att nå en slutlig koncentration av 10 till sex CFU per milliliter. Filtrera Escherichia coli-spetsad urin med ett femmikronfilter och dela den filtrerade bakterielösningen i 300 mikroliter alikvoter i sju 1,5-milliliter mikrorör och en 600 mikroliter alikvot i en 1,5-milliliter mikrotub. Utför deuteriuminkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika som beskrivits tidigare.

För att efterlikna de kliniska blodomloppsinfektionsproverna, spika Pseudomonas aeruginosa i en milliliter avidentifierat humant blod för att nå en slutlig koncentration av 10 till den sjätte CFU per milliliter. För att lysera blodet, tillsätt nio milliliter sterilt renat vatten. Filtrera Pseudomonas aeruginosa spikat blod med ett femmikron filter.

Skörda sedan bakterier från det filtrerade provet till en milliliter volym genom centrifugering vid 6 200 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering dela Pseudomonas aeruginosa spikade blodlösning i 300 mikroliter alikvoter i sju 1,5-milliliter mikrorör och en 600 mikroliter alikvot av bakterielösningen i en 1,5-milliliter mikrotub, och utför deuteriuminkorporeringsbehandling i närvaro av antibiotika som beskrivits tidigare. För provberedningen, tvätta en milliliter fast bakterielösning med renat vatten och centrifugera den tvättade bakterielösningen vid 6 200 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius.

Ta bort supernatanten och berika bakterielösningen till cirka 20 mikroliter med steriliserat vatten. Sätt in bakterielösningen på ett poly-L-lysinbelagt täckglas, smörgås med ett annat täckglas, och försegla provet. I SRS-mikroskopet ger en avstämbar femtosekundlaser med en repetitionshastighet på 80 megahertz pumpen och Stokes excitationslasrar.

Stokes-strålen moduleras av en akusto-optisk modulator vid 2,4 megahertz. De två strålarna kombineras kolinellt genom en dikroisk spegel. Sedan riktas pumpen och Stokes strålar in i ett labbbyggt laserscanningsmikroskop med en 2D Galvo-spegel för laserskanning.

Ett 60x vattenmål fokuserar lasrarna till provet och en oljekondensor samlar upp signalen från provet. Två filter används för att filtrera bort Stokes-strålen, medan pumpstrålen detekteras av en fotodiod, varefter den stimulerade Raman-signalen extraheras av en inlåsningsförstärkare. Använd styrprogramvaran för att mata in och ställa in pumpens våglängd till 852 nanometer.

Justera C till D vibrationsfrekvensen till 2, 168 vågnummer för att avbilda bakterier med hjälp av ett SRS-mikroskop. Mät lasereffekten med en effektmätare. Ställ in pumplaserns effekt vid provet på åtta milliwatt och effekten av Stokes-lasern vid provet till 50 milliwatt genom att justera halvvågsplattan framför laserutgången.

Placera standardprovet DMSO d6 på provsteget och använd ett 60x vattensänkningsmål för att fokusera pumpen och Stokes-lasrarna på provet. Genom att justera skruvarna på reflektionsspeglarna justerar du pumpens och Stokes strålar rumsligt och riktar de två strålarna till ett upprätt mikroskop utrustat med 2D Galvo-spegelsystem för laserskanning. I programvarans kontrollpanel ställer du in varje SRS-bild så att den innehåller 200 x 200 pixlar och pixelns uppehållstid till 30 mikrosekunder.

Den totala förvärvstiden för en bild är cirka 1,2 sekunder. Ställ in stegstorleken på 150 nanometer, så bildstorleken är cirka 30 x 30 mikrometer i kvadrat. Efter att ha optimerat systemet, ta ut standardprovet och lägg bakterieprovet på provsteget under 60x vattensänkningsmålet.

Starta SRS-avbildning av bakterieprover. Bild minst tre synfält för varje exempel. Inkubationstidens effekt på deuteriuminkorporering mäts genom spontan Raman-mikrospektroskopi vid CD- och CH-regionerna.

CD-över CH-intensitetsförhållandet över deuteriuminkubationstiden för enskilda bakterier visade ökande CD över CH-intensitet över inkubationstiden från noll till 180 minuter. SRS-avbildning av Pseudomonas aeruginosa utfördes vid inkubation med gentamicin och 70% deuterium. Den ytterligare kvantitativa statistiska analysen visade att CD-signaler från bakterier var signifikant lägre vid två mikrogram per milliliter, eller högre gentamicinkoncentration än utan gentamicinbehandling.

Tröskelvärdet för cutoff-intensitet vid 0,60 drog slutsatsen att Pseudomonas aeruginosa metaboliskt hämmades vid två mikrogram per milliliter och högre koncentrationer av gentamicin. SC-MIC för Pseudomonas aeruginosa mot gentamicin i ett normalt MHB-medium bestämdes till två mikrogram per milliliter, vilket låg inom det enfaldiga skillnadsintervallet med MIC på fyra mikrogram per milliliter bestämt med buljongmikrodilutionsmetoden. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing, eller AST, av Escherichia coli spikade urinprover utfördes av SRS imaging.

SC-MIC för Escherichia coli-spetsat urinprov mot amoxicillin bestämdes till fyra mikrogram per milliliter, vilket har samma känslighetsavläsning som MIC på åtta mikrogram per milliliter med den konventionella buljongutspädningsmetoden för ren Escherichia coli i normalt MHB-medium. Tillämpligheten av snabb ASAT av Pseudomonas aeruginosa spetsad i humant blod undersöktes genom SRS-avbildning. CD-intensiteten hos SRS-bilden vid 2 168 per centimeter dominerades av bakteriesignaler som härrör från den metaboliska deuteriuminkorporeringen av levande bakterier.

SC-MIC för Pseudomonas aeruginosa i blod bestämdes till två mikrogram per milliliter, vilket överensstämde väl med det konventionella standard MIC-resultatet för Pseudomonas aeruginosa i det normala tillväxtmediet. Bakteriecellnumret som används för testning av antimikrobiell mottaglighet hålls på cirka fem gånger 10 till de femte kolonibildande enheterna per milliliter, enligt rekommendationerna från Clinical and Laboratory Standards Institute. Högre bakteriekoncentration kan leda till en ökning av den minimala hämmande koncentrationen.

Att kombinera in situ-patogenidentifiering och snabb testning av antimikrobiell mottaglighet kan vara av stor potential för översättning till en klinik som möjliggör identifiering i tid av lämpliga antimikrobiella medel för exakt behandling.