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Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

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Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Article DOI: 10.3791/62398-v • 12:08 min

February 14th, 2022 •

Meng Zhang^1,2, Mohamed N. Seleem³, Ji-Xin Cheng^1,2,4,5

¹Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, ²Boston University Photonics Center, Boston University, ³Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, ⁴Department of Biomedical Engineering, Boston University, ⁵Department of Chemistry, Boston University

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February 14th, 2022

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Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D₂O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Transcript

Des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens peuvent être obtenus dans les 2,5 heures dans l’urine et le sang, ce qui est considéré comme une réduction considérable du temps d’analyse par rapport à la méthode conventionnelle de microdilution du bouillon. Il peut surveiller l’activité métabolique bactérienne dans un environnement complexe, comme le sang total. Pour commencer, vérifiez la concentration bactérienne des échantillons en mesurant la densité optique avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.

Pour atteindre une concentration cellulaire finale de huit fois 10 à la cinquième unité formant colonie, ou UFC, par millilitre, diluer la solution bactérienne en utilisant le milieu MHB normal sans deutérium. Après avoir mélangé les cellules bactériennes par vortex, prélever 300 microlitres aliquotes de la solution bactérienne dans sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 4,8 microlitres de la solution mère d’antibiotiques dans le microtube contenant 600 microlitres de la solution bactérienne pour atteindre la concentration finale d’antibiotique de huit microgrammes par millilitre.

Ajouter 300 microlitres de la solution bactérienne avec antibiotique à une partie aliquote de 300 microlitres de la solution bactérienne sans antibiotique pour obtenir une solution diluée double avec la concentration finale d’antibiotique de quatre microgrammes par millilitre. Répétez la double dilution en série des antibiotiques testés jusqu’à ce que la concentration la plus basse de 0,25 microgramme par millilitre soit atteinte. Jetez 300 microlitres de la solution du dernier microtube.

Attribuer un tube sans antibiotiques au témoin positif avec traitement au deutérium et au témoin négatif sans deutérium. Incuber l’aliquote bactérienne avec l’antibiotique contenant le milieu MHB pendant une heure. Pendant ce temps, préparer une dilution en série d’antibiotiques avec un milieu MHB contenant du deutérium à 100% avec les mêmes gradients de concentration que ceux décrits précédemment.

Après une heure d’incubation, ajouter 700 microlitres d’antibiotique dilué en série avec un milieu MHB contenant du deutérium à 100% aux 300 microlitres de bactéries prétraitées aux antibiotiques dans la même concentration d’antibiotique. Homogénéiser le mélange en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Ajouter 700 microlitres de milieu 100% deutérium sans antibiotique contenant du milieu MHB à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques comme contrôle positif.

Ajouter 700 microlitres de milieu 0% de deutérium sans antibiotique contenant du milieu MHB à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques comme contrôle négatif. Incuber tous les microtubes à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute pendant 30 minutes. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon bactérien traité au millilitre d’antibiotique et au deutérium à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez le granulé deux fois avec de l’eau purifiée. Fixez les échantillons dans une solution de formol à 10% volume par volume et conservez-les à quatre degrés Celsius. Vérifiez la concentration d’Escherichia coli à partir de l’échantillon bactérien fraîchement préparé en mesurant la densité optique avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.

Pour imiter les échantillons cliniques d’infection des voies urinaires, augmenter l’échantillon d’Escherichia coli dans 10 millilitres d’échantillons d’urine anonymisés pour atteindre une concentration finale de 10 à six UFC par millilitre. Filtrer l’urine enrichie d’Escherichia coli à l’aide d’un filtre de cinq microns et diviser la solution bactérienne filtrée en aliquotes de 300 microlitres en sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres dans un microtube de 1,5 millilitre. Effectuer un traitement d’incorporation de deutérium en présence d’antibiotiques comme décrit précédemment.

Pour imiter les échantillons cliniques d’infection sanguine, ajoutez Pseudomonas aeruginosa dans un millilitre de sang humain anonymisé pour atteindre une concentration finale de 10 à la sixième UFC par millilitre. Pour lyser le sang, ajoutez neuf millilitres d’eau purifiée stérile. Filtrer le sang enrichi de Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un filtre de cinq microns.

Ensuite, récoltez les bactéries de l’échantillon filtré à un volume d’un millilitre par centrifugation à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, diviser la solution sanguine enrichie de Pseudomonas aeruginosa dans des aliquotes de 300 microlitres en sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 millilitre, et effectuer un traitement d’incorporation de deutérium en présence d’antibiotiques comme décrit précédemment. Pour la préparation de l’échantillon, laver un millilitre de solution bactérienne fixe avec de l’eau purifiée et centrifuger la solution de bactéries lavées à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Retirer le surnageant et enrichir la solution bactérienne à environ 20 microlitres avec de l’eau stérilisée. Déposer la solution bactérienne sur un verre de couverture revêtu de poly-L-lysine, sandwich avec un autre verre de couverture, et sceller l’échantillon. Dans le microscope SRS, un laser femtoseconde accordable avec un taux de répétition de 80 mégahertz fournit la pompe et les lasers d’excitation de Stokes.

Le faisceau de Stokes est modulé par un modulateur acousto-optique à 2,4 mégahertz. Les deux faisceaux sont combinés colilinéairement à travers un miroir dichroïque. Ensuite, la pompe et les faisceaux de Stokes sont dirigés vers un microscope à balayage laser construit en laboratoire avec un miroir Galvo 2D pour le balayage laser.

Un objectif d’eau 60x focalise les lasers sur l’échantillon et un condenseur d’huile recueille le signal de l’échantillon. Deux filtres sont utilisés pour filtrer le faisceau de Stokes, tandis que le faisceau de la pompe est détecté par une photodiode, après quoi le signal Raman stimulé est extrait par un amplificateur de verrouillage. À l’aide du logiciel de contrôle, entrez et réglez la longueur d’onde de la pompe à 852 nanomètres.

Ajustez la fréquence vibratoire C à D à 2 168 ondes pour imager les bactéries à l’aide d’un microscope SRS. Mesurez la puissance laser à l’aide d’un capteur de puissance. Réglez la puissance du laser de la pompe sur l’échantillon à huit milliwatts et la puissance du laser Stokes sur l’échantillon à 50 milliwatts en ajustant la plaque demi-onde devant la sortie laser.

Placez l’échantillon standard DMSO d6 sur l’étage d’échantillonnage et utilisez un objectif d’immersion dans l’eau 60x pour focaliser la pompe et les lasers Stokes sur l’échantillon. En ajustant les vis des miroirs de réflexion, alignez spatialement la pompe et les faisceaux de Stokes et dirigez les deux faisceaux dans un microscope vertical équipé du système de miroir 2D Galvo pour le balayage laser. Dans le panneau de configuration du logiciel, définissez chaque image SRS pour qu’elle contienne 200 x 200 pixels et que le temps d’attente des pixels soit de 30 microsecondes.

Le temps total d’acquisition d’une image est d’environ 1,2 seconde. Définissez la taille du pas sur 150 nanomètres, de sorte que la taille de l’image est d’environ 30 par 30 micromètres carrés. Après avoir optimisé le système, retirez l’échantillon standard et placez l’échantillon bactérien sur l’étape de l’échantillon sous l’objectif d’immersion dans l’eau 60x.

Démarrez l’imagerie SRS des échantillons bactériens. Image d’au moins trois champs de vision pour chaque échantillon. L’effet du temps d’incubation sur l’incorporation de deutérium est mesuré par microspectroscopie Raman spontanée dans les régions CD et CH.

Le diagramme du rapport d’intensité CD sur CH sur le temps d’incubation du deutérium pour les bactéries individuelles a montré une augmentation de l’intensité CD sur CH sur le temps d’incubation de zéro à 180 minutes. L’imagerie SRS de Pseudomonas aeruginosa a été réalisée lors de l’incubation avec de la gentamicine et du deutérium à 70%. L’analyse statistique quantitative supplémentaire a montré que les signaux CD des bactéries étaient significativement plus faibles à deux microgrammes par millilitre, ou une concentration de gentamicine plus élevée que sans traitement à la gentamicine.

Le seuil d’intensité seuil à 0,60 a conclu que Pseudomonas aeruginosa était métaboliquement inhibé à deux microgrammes par millilitre et à des concentrations plus élevées de gentamicine. La CMI-SC pour Pseudomonas aeruginosa contre la gentamicine dans un milieu MHB normal a été déterminée à deux microgrammes par millilitre, ce qui se situait dans la plage de différence d’un seul fois avec une CMI de quatre microgrammes par millilitre déterminée par la méthode de microdilution du bouillon. Des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens, ou AST, d’échantillons d’urine enrichis d’Escherichia coli ont été effectués par imagerie SRS.

La CMI-SC de l’échantillon d’urine enrichie d’Escherichia coli contre l’amoxicilline a été déterminée à quatre microgrammes par millilitre, ce qui a la même lecture de sensibilité que la CMI de huit microgrammes par millilitre par la méthode de dilution conventionnelle du bouillon pour Escherichia coli pur dans un milieu MHB normal. L’applicabilité de l’AST rapide de Pseudomonas aeruginosa enrichi dans le sang humain a été étudiée par imagerie SRS. L’intensité CD de l’image SRS à 2 168 centimètres était dominée par des signaux bactériens provenant de l’incorporation métabolique de deutérium de bactéries vivantes.

La CMI-SC pour Pseudomonas aeruginosa dans le sang a été déterminée à deux microgrammes par millilitre, ce qui concorde bien avec le résultat standard conventionnel de la CMI pour Pseudomonas aeruginosa dans le milieu de croissance normal. Le nombre de cellules bactériennes utilisées pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens est maintenu à environ cinq fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par millilitre, comme recommandé par le Clinical and Laboratory Standards Institute. Une concentration plus élevée de bactéries peut entraîner une augmentation de la concentration minimale inhibitrice.

La combinaison de l’identification in situ des agents pathogènes et du diagnostic rapide des tests de sensibilité aux antimicrobiens pourrait être d’un grand potentiel de traduction dans une clinique qui permet d’identifier à temps les agents antimicrobiens appropriés pour un traitement précis.

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