Biology
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एकल जीवाणु में ड्यूटेरियम निगमन के उत्तेजित रमन स्कैटरिंग इमेजिंग द्वारा रैपिड एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण
Chapters
Summary February 14th, 2022
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यहप्रोटोकॉल डी 2ओ चयापचय के एकल-कोशिका-उत्तेजित रमन प्रकीर्णन इमेजिंग द्वारा 2.5 घंटे के भीतर तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) परख प्रस्तुत करता है। यह विधि मूत्र या पूरे रक्त वातावरण में बैक्टीरिया पर लागू होती है, जो क्लिनिक में तेजी से एकल-कोशिका फेनोटाइपिक एएसटी के लिए परिवर्तनकारी है।
Transcript
मूत्र और रक्त में 2.5 घंटे के भीतर तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण प्राप्त किया जा सकता है, जिसे पारंपरिक शोरबा माइक्रोडायल्यूशन विधि की तुलना में विश्लेषण समय में जबरदस्त कमी माना जाता है। यह एक जटिल वातावरण में जीवाणु चयापचय गतिविधि की निगरानी कर सकता है, जैसे कि पूरे रक्त। शुरू करने के लिए, 600 नैनोमीटर तरंग दैर्ध्य पर फोटोमीटर के साथ ऑप्टिकल घनत्व को मापकर नमूनों से जीवाणु एकाग्रता की जांच करें।
पांचवीं कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों, या सीएफयू, प्रति मिलीलीटर तक आठ गुना 10 गुना की अंतिम सेल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए, ड्यूटेरियम के बिना सामान्य एमएचबी माध्यम का उपयोग करके जीवाणु समाधान को पतला करें। भंवर द्वारा जीवाणु कोशिकाओं को मिलाने के बाद, सात 1.5-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में बैक्टीरिया के घोल के 300 माइक्रोलीटर एलिकोट और एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में जीवाणु समाधान के 600 माइक्रोलीटर एलिकोट को हटा दें। फिर आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया समाधान के 600 माइक्रोलीटर युक्त माइक्रोट्यूब में एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान के 4.8 माइक्रोलीटर जोड़ें।
एंटीबायोटिक के बिना बैक्टीरिया के समाधान के 300 माइक्रोलीटर एलिकोट में एंटीबायोटिक के साथ बैक्टीरिया के समाधान के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता के साथ दो गुना पतला समाधान प्राप्त किया जा सके। परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं के दोहरे सीरियल कमजोर पड़ने को तब तक दोहराएं जब तक कि 0.25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की सबसे कम सांद्रता तक नहीं पहुंच जाती। अंतिम माइक्रोट्यूब से समाधान के 300 माइक्रोलीटर को हटा दें।
ड्यूटेरियम उपचार के साथ सकारात्मक नियंत्रण के लिए बिना एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक ट्यूब आवंटित करें, और बिना ड्यूटेरियम के नकारात्मक नियंत्रण। एक घंटे के लिए एमएचबी माध्यम युक्त एंटीबायोटिक के साथ बैक्टीरियल एलिकोट को इनक्यूबेट करें। इस बीच, पहले वर्णित एकाग्रता ग्रेडिएंट के साथ एमएचबी माध्यम युक्त 100% ड्यूटेरियम के साथ एंटीबायोटिक दवाओं का एक सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
इनक्यूबेशन के एक घंटे के बाद, एंटीबायोटिक एकाग्रता में एंटीबायोटिक पूर्व-उपचारित बैक्टीरिया के 300 माइक्रोलीटर में एमएचबी माध्यम युक्त 100% ड्यूटेरियम के साथ क्रमिक रूप से पतला एंटीबायोटिक के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण को कई बार ऊपर और नीचे करके समरूप करें। सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एंटीबायोटिक मुक्त बैक्टीरिया के 300 माइक्रोलीटर में एमएचबी माध्यम युक्त एंटीबायोटिक-मुक्त 100% ड्यूटेरियम के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें।
नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एंटीबायोटिक मुक्त बैक्टीरिया के 300 माइक्रोलीटर में एमएचबी माध्यम युक्त एंटीबायोटिक-मुक्त 0% ड्यूटेरियम के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें। सभी माइक्रोट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस और 200 रोटेशन प्रति मिनट पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एंटीबायोटिक और ड्यूटेरियम के एक मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ने चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 6,200 गुना ग्राम पर बैक्टीरिया के नमूने का इलाज किया।
फिर शुद्ध पानी से दो बार गोली धो लें। वॉल्यूम फॉर्मेलिन समाधान द्वारा नमूने को 10% मात्रा में ठीक करें, और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 600 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य पर फोटोमीटर के साथ ऑप्टिकल घनत्व को मापकर ताजा तैयार जीवाणु नमूने से एस्चेरिचिया कोलाई एकाग्रता की जांच करें।
नैदानिक मूत्र पथ के संक्रमण के नमूनों की नकल करने के लिए, एस्चेरिचिया कोलाई नमूने को 10 मिलीलीटर में डी-आइडेंटिफाइड मूत्र के नमूनों में स्पाइक करें ताकि प्रति मिलीलीटर छह सीएफयू की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके। पांच माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई स्पाइक्ड मूत्र को फ़िल्टर करें, और फ़िल्टर किए गए जीवाणु समाधान को 300 माइक्रोलीटर एलिकोट में सात 1.5-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में विभाजित करें, और एक 1.5-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में 600 माइक्रोलीटर एलिकोट। पहले वर्णित एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में ड्यूटेरियम निगमन उपचार करें।
नैदानिक रक्तप्रवाह संक्रमण के नमूनों की नकल करने के लिए, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा को एक मिलीलीटर मानव रक्त में स्पाइक करें ताकि प्रति मिलीलीटर 10 से छठे सीएफयू की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके। रक्त को पतला करने के लिए, बाँझ शुद्ध पानी के नौ मिलीलीटर जोड़ें। स्यूडोमोनास एरुगिनोसा स्पाइक्ड रक्त को पांच माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर करें।
फिर फ़िल्टर किए गए नमूने से बैक्टीरिया को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 6,200 गुना ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक मिलीलीटर मात्रा में काटें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा स्पाइक्ड रक्त समाधान को 300 माइक्रोलीटर एलिकोट में सात 1.5-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब और एक 1.5-मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में जीवाणु समाधान के 600 माइक्रोलीटर एलिकोट में विभाजित करें, और एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में ड्यूटेरियम निगमन उपचार करें जैसा कि पहले वर्णित है। नमूना तैयार करने के लिए, शुद्ध पानी के साथ एक मिलीलीटर निश्चित बैक्टीरिया के घोल को धोएं, और धोए गए बैक्टीरिया के घोल को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 6,200 गुना ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
सतह पर तैरने वाले को हटा दें और जीवाणु समाधान को निष्फल पानी के साथ लगभग 20 माइक्रोलीटर तक समृद्ध करें। एक पॉली-एल-लाइसिन लेपित कवर ग्लास पर जीवाणु समाधान जमा करें, एक और कवर ग्लास के साथ सैंडविच, और नमूने को सील करें। एसआरएस माइक्रोस्कोप में, 80 मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर के साथ एक असमर्थ फेम्टोसेकंड लेजर पंप और स्टोक्स उत्तेजना लेजर प्रदान करता है।
स्टोक्स बीम को 2.4 मेगाहर्ट्ज पर एक एकोस्टो-ऑप्टिकल मॉड्यूलेटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है। दो बीम एक डाइक्रोइक दर्पण के माध्यम से सहरेखीय रूप से संयुक्त होते हैं। फिर पंप और स्टोक्स बीम को लेजर स्कैनिंग के लिए 2 डी गैल्वो मिरर के साथ एक प्रयोगशाला-निर्मित लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में निर्देशित किया जाता है।
एक 60x जल उद्देश्य नमूने पर लेजर केंद्रित करता है और एक तेल कंडेनसर नमूने से संकेत एकत्र करता है। स्टोक्स बीम को फ़िल्टर करने के लिए दो फिल्टर का उपयोग किया जाता है, जबकि पंप बीम का पता एक फोटोडायोड द्वारा लगाया जाता है, जिसके बाद उत्तेजित रमन सिग्नल को लॉक-इन एम्पलीफायर द्वारा निकाला जाता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, पंप तरंग दैर्ध्य को 852 नैनोमीटर तक इनपुट और ट्यून करें।
एसआरएस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बैक्टीरिया की छवि बनाने के लिए सी से डी कंपन आवृत्ति को 2, 168 तरंग संख्या में समायोजित करें। पावर मीटर का उपयोग करके लेजर पावर को मापें। नमूने में पंप लेजर की शक्ति को आठ मिलीवाट पर सेट करें, और लेजर आउटपुट के सामने अर्ध-तरंग प्लेट को समायोजित करके नमूने पर स्टोक्स लेजर की शक्ति 50 मिलीवाट तक सेट करें।
नमूना चरण पर मानक नमूना डीएमएसओ डी 6 रखें, और नमूने पर पंप और स्टोक्स लेजर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 60x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें। प्रतिबिंब दर्पणों के पेंच को समायोजित करके, पंप और स्टोक्स बीम को स्थानिक रूप से संरेखित करें और लेजर स्कैनिंग के लिए 2 डी गैल्वो मिरर सिस्टम से लैस एक सीधे माइक्रोस्कोप में दो बीम को निर्देशित करें। सॉफ्टवेयर नियंत्रण कक्ष में, प्रत्येक एसआरएस छवि को 200 से 200 पिक्सेल और पिक्सेल निवास समय को 30 माइक्रोसेकंड तक सेट करें।
एक छवि के लिए कुल अधिग्रहण समय लगभग 1.2 सेकंड है। चरण आकार को 150 नैनोमीटर पर सेट करें, इसलिए छवि का आकार लगभग 30 बाय 30 माइक्रोमीटर वर्ग है। सिस्टम को अनुकूलित करने के बाद, मानक नमूना लें, और 60x जल विसर्जन उद्देश्य के तहत नमूना चरण पर जीवाणु नमूना डालें।
जीवाणु नमूनों की एसआरएस इमेजिंग शुरू करें। प्रत्येक नमूने के लिए दृश्य के कम से कम तीन क्षेत्रों की छवि। ड्यूटेरियम निगमन पर इनक्यूबेशन समय का प्रभाव सीडी और सीएच क्षेत्रों में सहज रमन माइक्रोस्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है।
एकल बैक्टीरिया के लिए ड्यूटेरियम इनक्यूबेशन समय पर सीडी ने शून्य से 180 मिनट तक इनक्यूबेशन समय में सीएच तीव्रता पर सीडी में वृद्धि दिखाई। स्यूडोमोनास एरुगिनोसा की एसआरएस इमेजिंग जेंटामाइसिन और 70% ड्यूटेरियम के साथ इनक्यूबेशन पर आयोजित की गई थी। आगे मात्रात्मक सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि बैक्टीरिया के सीडी सिग्नल दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर काफी कम थे, या जेंटामाइसिन उपचार के बिना उच्च जेंटामाइसिन एकाग्रता थी।
0.60 पर कटऑफ तीव्रता सीमा ने निष्कर्ष निकाला कि स्यूडोमोनास एरुगिनोसा चयापचय रूप से दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और जेंटामाइसिन की उच्च सांद्रता पर बाधित था। एक सामान्य एमएचबी माध्यम में जेंटामाइसिन के खिलाफ स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए एससी-एमआईसी को दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर निर्धारित किया गया था, जो शोरबा माइक्रोडायल्यूशन विधि द्वारा निर्धारित चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के एमआईसी के साथ एक गुना अंतर सीमा के भीतर था। एसआरएस इमेजिंग द्वारा एस्चेरिचिया कोलाई स्पाइक्ड मूत्र के नमूनों का रैपिड एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण, या एएसटी किया गया था।
एमोक्सिसिलिन के खिलाफ एस्चेरिचिया कोलाई स्पाइक्ड मूत्र के नमूने के लिए एससी-एमआईसी को चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर निर्धारित किया गया था, जिसमें सामान्य एमएचबी माध्यम में शुद्ध एस्चेरिचिया कोलाई के लिए पारंपरिक शोरबा कमजोर पड़ने की विधि द्वारा आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के एमआईसी के समान संवेदनशीलता है। एसआरएस इमेजिंग द्वारा मानव रक्त में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा स्पाइक के तेजी से एएसटी की प्रयोज्यता की जांच की गई थी। 2, 168 प्रति सेंटीमीटर पर एसआरएस छवि की सीडी तीव्रता जीवित बैक्टीरिया के चयापचय ड्यूटेरियम निगमन से उत्पन्न जीवाणु संकेतों पर हावी थी।
रक्त में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए एससी-एमआईसी को दो माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर निर्धारित किया गया था, जो सामान्य विकास माध्यम में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के लिए पारंपरिक मानक एमआईसी परिणाम के साथ अच्छी तरह से सहमत था। एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरियल सेल नंबर को नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान द्वारा अनुशंसित इकाइयों को प्रति मिलीलीटर पांचवीं कॉलोनी बनाने के लिए लगभग पांच गुना 10 गुना रखा जाता है। उच्च बैक्टीरिया एकाग्रता से न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता में वृद्धि हो सकती है।
सीटू रोगज़नक़ पहचान और तेजी से रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण निदान का संयोजन एक क्लिनिक में अनुवाद के लिए बड़ी क्षमता हो सकती है जो सटीक उपचार के लिए उपयुक्त रोगाणुरोधी एजेंटों की समय पर पहचान की अनुमति देता है।
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