Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests kunnen binnen 2,5 uur in urine en bloed worden verkregen, wat wordt beschouwd als een enorme vermindering van de analysetijd in vergelijking met de conventionele bouillonmicroverdunningsmethode. Het kan bacteriële metabole activiteit in een complexe omgeving, zoals volbloed, volgen. Controleer om te beginnen de bacteriële concentratie van de monsters door de optische dichtheid te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nanometer.

Om een uiteindelijke celconcentratie van acht keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden, of CFU, per milliliter te bereiken, verdunt u de bacteriële oplossing met behulp van het normale MHB-medium zonder deuterium. Na het mengen van de bacteriële cellen door vortex, verwijdert u 300 microliter aliquots van de bacteriële oplossing in zeven 1,5-milliliter microbuisjes en een 600 microliter aliquot van de bacteriële oplossing in een 1,5-milliliter microbuis. Voeg vervolgens 4,8 microliter van de antibioticumvoorraadoplossing toe aan de microbuis met 600 microliter van de bacteriële oplossing om de uiteindelijke antibioticaconcentratie van acht microgram per milliliter te bereiken.

Voeg 300 microliter van de bacteriële oplossing met antibioticum toe aan een aliquot van 300 microliter van de bacteriële oplossing zonder antibioticum om een tweevoudige verdunde oplossing te bereiken met de uiteindelijke antibioticaconcentratie van vier microgram per milliliter. Herhaal de tweevoudige seriële verdunning van de testantibiotica totdat de laagste concentratie van 0,25 microgram per milliliter is bereikt. Gooi 300 microliter van de oplossing uit de laatste microbuis weg.

Wijs één buis zonder antibiotica toe aan de positieve controle met deuteriumbehandeling en de negatieve controle zonder deuterium. Incubeer het bacteriële aliquot met het antibioticum dat MHB-medium bevat gedurende één uur. Bereid ondertussen een seriële verdunning van antibiotica met 100% deuteriumhoudend MHB-medium met dezelfde concentratiegradiënten als eerder beschreven.

Voeg na een uur incubatie 700 microliter antibioticum serieel verdund met 100% deuteriumhoudend MHB-medium toe aan de 300 microliter voorbehandelde antibioticabacteriën in dezelfde antibioticaconcentratie. Homogeniseer het mengsel door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg 700 microliter antibioticavrije 100% deuteriumhoudende MHB-medium toe aan 300 microliter antibioticavrije bacteriën als een positieve controle.

Voeg 700 microliter antibioticavrije 0% deuteriumhoudende MHB-medium toe aan 300 microliter antibioticavrije bacteriën als negatieve bestrijding. Incubeer alle microbuisjes bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut gedurende 30 minuten. Na incubatie, centrifugeer het ene milliliter met antibiotica en deuterium behandelde bacteriële monster op 6, 200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Was de pellet vervolgens twee keer met gezuiverd water. Bevestig de monsters in een formalineoplossing van 10% volume per volume en bewaar ze bij vier graden Celsius. Controleer de Escherichia coli-concentratie van het vers bereide bacteriële monster door de optische dichtheid te meten met een fotometer op een golflengte van 600 nanometer.

Om de klinische urineweginfectiemonsters na te bootsen, piekt u het Escherichia coli-monster in 10 milliliter gedeïdentificeerde urinemonsters om een uiteindelijke concentratie van 10 tot de zes CFU per milliliter te bereiken. Filter de Escherichia coli spiked urine met behulp van een filter van vijf micron en verdeel de gefilterde bacteriële oplossing in 300 microliter aliquots in zeven microbuizen van 1,5 milliliter en een aliquot van 600 microliter in één microbuisje van 1,5 milliliter. Voer deuteriumincorporatiebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica zoals eerder beschreven.

Om de klinische bloedbaaninfectiemonsters na te bootsen, spike Pseudomonas aeruginosa in één milliliter gedeïdentificeerd menselijk bloed om een uiteindelijke concentratie van 10 tot de zesde CFU per milliliter te bereiken. Om het bloed te lyseren, voeg je negen milliliter steriel gezuiverd water toe. Filter het Pseudomonas aeruginosa spiked bloed met behulp van een filter van vijf micron.

Oogst vervolgens bacteriën uit het gefilterde monster tot een volume van één milliliter door centrifugeren bij 6.200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verdeel na centrifugatie de Pseudomonas aeruginosa spiked bloedoplossing in 300 microliter aliquots in zeven 1,5-milliliter microbuisjes en een 600 microliter aliquot van de bacteriële oplossing in één 1,5-milliliter microbuis en voer deuterium-opnamebehandeling uit in aanwezigheid van antibiotica zoals eerder beschreven. Was voor de monstervoorbereiding een milliliter vaste bacterieoplossing met gezuiverd water en centrifugeer de gewassen bacterie-oplossing op 6, 200 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en verrijk de bacteriële oplossing tot ongeveer 20 microliter met gesteriliseerd water. Deponeer de bacteriële oplossing op een poly-L-lysine gecoat afdekglas, sandwich met een ander afdekglas en sluit het monster af. In de SRS-microscoop levert een instelbare femtosecondelaser met een herhalingsfrequentie van 80 megahertz de pomp- en Stokes-excitatielasers.

De Stokes-bundel wordt gemoduleerd door een acousto-optische modulator van 2,4 megahertz. De twee balken worden colinear gecombineerd door middel van een dichroïsche spiegel. Vervolgens worden de pomp en Stokes-stralen in een in het laboratorium gebouwde laserscanmicroscoop geleid met een 2D Galvo-spiegel voor laserscanning.

Een waterprester van 60x richt de lasers op het monster en een oliecondensor verzamelt het signaal van het monster. Twee filters worden gebruikt om de Stokes-straal eruit te filteren, terwijl de pompbundel wordt gedetecteerd door een fotodiode, waarna het gestimuleerde Raman-signaal wordt geëxtraheerd door een lock-in versterker. Met behulp van de besturingssoftware voert u de golflengte van de pomp in en stemt u deze af op 852 nanometer.

Stel de trillingsfrequentie C tot D in op 2, 168 golfnummer om bacteriën in beeld te brengen met behulp van een SRS-microscoop. Meet het laservermogen met behulp van een vermogensmeter. Stel het vermogen van de pomplaser op het monster in op acht milliwatt en het vermogen van de Stokes-laser op het monster op 50 milliwatt door de halfgolfplaat voor de laseruitgang aan te passen.

Plaats het standaardmonster DMSO d6 op het monsterstadium en gebruik een 60x waterdompelingsobjectief om de pomp en Stokes-lasers op het monster te richten. Door de schroeven van de reflectiespiegels af te stellen, de pomp- en Stokes-stralen ruimtelijk uit te lijnen en de twee stralen in een rechtopstaande microscoop te leiden die is uitgerust met een 2D Galvo-spiegelsysteem voor laserscanning. Stel in het bedieningspaneel van de software elke SRS-afbeelding in op 200 bij 200 pixels en de pixelverblijftijd op 30 microseconden.

De totale acquisitietijd voor één afbeelding is ongeveer 1,2 seconden. Stel de stapgrootte in op 150 nanometer, zodat de beeldgrootte ongeveer 30 bij 30 micrometer in het kwadraat is. Nadat u het systeem hebt geoptimaliseerd, haalt u het standaardmonster eruit en plaatst u het bacteriële monster op het monsterstadium onder het doel van 60x waterdompeling.

Start de SRS-beeldvorming van bacteriële monsters. Afbeelding van ten minste drie gezichtsvelden voor elk voorbeeld. Het effect van incubatietijd op de deuteriumincorporatie wordt gemeten door spontane Raman-microspectroscopie in de CD- en CH-regio’s.

De CD over CH intensiteit ratio plot over deuterium incubatietijd voor enkele bacteriën toonde toenemende CD over CH intensiteit over incubatietijd van nul tot 180 minuten. SRS-beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa werd uitgevoerd na incubatie met gentamicine en 70% deuterium. De verdere kwantitatieve statistische analyse toonde aan dat CD-signalen van bacteriën significant lager waren bij twee microgram per milliliter, of een hogere gentamicineconcentratie dan zonder gentamicinebehandeling.

De cutoff intensiteitsdrempel bij 0,60 concludeerde dat Pseudomonas aeruginosa metabolisch geremd was bij twee microgram per milliliter en hogere concentraties gentamicine. De SC-MIC voor Pseudomonas aeruginosa tegen gentamicine in een normaal MHB-medium werd bepaald op twee microgram per milliliter, wat binnen het eenvoudige verschilbereik met MIC van vier microgram per milliliter lag, bepaald door de bouillonmicroverdunningsmethode. Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests, of AST, van Escherichia coli spiked urinemonsters werden uitgevoerd door SRS-beeldvorming.

De SC-MIC voor het Escherichia coli spiked urinemonster tegen amoxicilline werd vastgesteld op vier microgram per milliliter, dat dezelfde gevoeligheidsuitlezing heeft als de MIC van acht microgram per milliliter volgens de conventionele bouillonverdunningsmethode voor pure Escherichia coli in normaal MHB-medium. De toepasbaarheid van snelle ASAT van Pseudomonas aeruginosa piek in menselijk bloed werd onderzocht door middel van SRS-beeldvorming. De CD-intensiteit van het SRS-beeld bij 2.168 per centimeter werd gedomineerd door bacteriële signalen afkomstig van de metabole deuteriumincorporatie van levende bacteriën.

De SC-MIC voor Pseudomonas aeruginosa in het bloed werd vastgesteld op twee microgram per milliliter, wat goed overeenkwam met het conventionele standaard MIC-resultaat voor Pseudomonas aeruginosa in het normale groeimedium. Het bacteriële celnummer dat wordt gebruikt voor antimicrobiële gevoeligheidstests wordt op ongeveer vijf keer 10 tot de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter gehouden, zoals aanbevolen door het Clinical and Laboratory Standards Institute. Een hogere bacterieconcentratie kan leiden tot een toename van de minimale remmende concentratie.

Het combineren van in situ pathogene identificatie en snelle antimicrobiële gevoeligheidstestdiagnostiek zou een groot potentieel kunnen hebben voor vertaling naar een kliniek die tijdige identificatie van geschikte antimicrobiële middelen voor nauwkeurige behandeling mogelijk maakt.