חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה עדיין אינו מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת המצבים המוקדמים של ריפוי במהלך אינטראקציה לישמניה לתאים המארחים. טכניקה זו מציגה את היתרון העיקרי, המאפשר את המחקר של מצבים שונים של לישמניה phagocytosis והשתתפות של מספר חלבונים.

ראוי לציין כי טכניקה זו יכולה להיות מורחבת גם סוגים אחרים של מחקרים, כולל זיהום על ידי חיידקים, שמרים, או בין אם זה נבלע על ידי סוגים אחרים של תאים. אנשים שמנסים את הטכניקה הזו צריכים לדאוג לזמן החשיפה של התאים לתמיסת Nucleofector. בנוסף, אנו מציעים להתחיל לבדוק את ההעברה באמצעות מקסימום של שני פלסמידים.

מי שתדגים את ההליך תהיה אמנדה רבוקס, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. ראשית, זרעו 0.2 מיליון תאי THP-1, או מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים ב-500 מיקרוליטרים RPMI לבאר על צלחת 24 באר עם כיסויי זכוכית של 13 מילימטר. יש לדגום במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני, לשטוף תאים פעמיים עם 0.9% מי מלח ולדגירה על התאים במדיום RPMI שלם.

הוספת מיני לישמניה פאזה נייחת לתאים בטפיל 10 היא ליחס תא מארח אחד, ולאחר מכן, צנטריפוגה ב 720 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, שטפו את התאים פעמיים בתמיסת מלח של 0.9% כדי להסיר פרומסטיגוטים שאינם מופנמים. דגירה של התאים בתוספת RPMI Medium בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן, תקן את התאים עם 4% PFA למשך 15 דקות.

לאחר מכן, הרכב כיסויים באמצעות מדיית הרכבה מועדפת. לאחר מכן, ספרו לפחות 400 תאים בשדות אקראיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לחקור את הביוגנזה ה-PV הנגרמת על-ידי לישמניה, התחל להעביר תאי THP-1 עם פלסמיד על-ידי זריעת 15 מיליון תאי THP-1 ב-75 סנטימטרים רבועים של צלוחיות תרבית רקמה המכילות 10 מיליליטר של Complete RPMI Medium בתוספת 100 ננוגרם למיליליטר PMA, ו-50 מיקרומולר למרקפטואתנול למשך 48 שעות.

לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת בתמיסת מלח 0.9% ונתקו את התאים באמצעות תמיסת דיסוציאציה לא אנזימטית של תאים. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 250 פעמים גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השהה את תאי ה- THP-1 במיליליטר אחד של RPMI Medium ובצע ספירות בתא נויבאואר.

צנטריפוגה של התאים שוב ב 250 פעמים גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. יש לתלות 2 מיליון תאים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת Nucleofector ולדגור עם 0.5 מיקרוגרם של ציפוי פלסמיד עבור החלבון המעניין, המתויג עם חלבון פלואורסצנטי. העבר את התרחיף המכיל תאי THP-1 וחומצת גרעין ל- Nucleofector cuvette.

לאחר מכן, טרנספקט את התאים באמצעות תוכנית Nucleofector Y אחד. לשחזר את התאים transfected ואת הזרעים ב 500 microliters של RPMI בינוני על 24 לוחות באר עם כיסויי זכוכית 13 מילימטר. דגירה של התאים ומדיום RPMI מלא ב-37 מעלות צלזיוס למשך 0.5, 2, 4, 6, 12 ו-24 שעות.

השאירו את כיסויי הזכוכית בקוטר 13 מילימטר בטמפרטורת החדר והגנו עליהם מפני האור לפחות 30 דקות לפני הרכישה. נקו את הכיסויים עם רקמה סופגת. לאחר מכן, הוסף טיפה של שמן טבילה למטרה, ולאחר מכן הוסף את השקופית.

הזיזו את המטרה כלפי מעלה עד שהשמן ייגע בשקופית. התבוננו והתאימו את הפוקוס למיקרוסקופ ובחרו באופציה 63x אובייקטיבית עם שמן. פתח את תוכנית LIQA והתאם את הלייזרים באורכי הגל 488, 552 ו- 405.

בחר ברזולוציית התמונה כ- 1024 x 1024. לאחר לחיצה על כפתור החי, הגדר את Z-stack ולחץ על אפשרות ההתחלה. המתן לרכישת התמונה ולאחר מכן בחר את האפשרות, הקרנה מקסימלית, בכלים.

שמור את הניסוי וייצא את התמונות בתבנית TIFF למחשב. התוצאות הראו שגם לישמניה ברזילאית LCL, וגם לישמניה ברזילאית DL, נקשרים באופן דומה למקרופאגים. כמו כן, לא נצפו הבדלים לגבי לישמניה ברזילאית LCL ולישמניה ברזילאית DL פאגוציטוזה על ידי תאים מארחים.

הגיוס של LC3 לוואקולה הטפילית, או PV’s, המושרה על ידי לישמניה ברזילינזיס LCL או לישמניה ברזילינזיס DL, הושווה בתאים נגועים. לאחר ארבע שעות של הדבקה, נצפו אחוזים דומים של PV’s מעוטרים ב-LC3 במקרופאגים נגועים בלישמניה ברזילי LCL ובמקרופאגים נגועים ב-Leishmania Braziliensis DL. לפיכך, התוצאות הראו כי Leishmania Braziliensis LCL ו- Leishmania Braziliensis DL מתקשרות באופן דומה עם מקרופאגים במהלך קשירה, פאגוציטוזה וביוגנזה של PV’s בנוגע לגיוס LC3.

תמונות מיקרוסקופיות מייצגות הדגימו העברה יעילה של תאי THP-1 עם פלסמידים מסוג PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. אנשים שמנסים את הפרוטוקול הזה חייבים לשים לב לדגירה של הטמפרטורה ולהגן על דגימות המיקרוסקופ מפני האור, על כל הסוגים. ויסות הביטוי של החלבונים המזוהים המזרזים את לישמניה פאגוציטוזה ידגים את חשיבותם של חלבונים אלה בתוצאות זיהום לישמניה.

אנו יכולים להרחיב טכניקה זו לעבר סוגים שונים של מחקרים פתולוגיים ומנגנונים הקשורים להקמת טפילים וזיהוי מטרה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.