Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí describimos métodos para evaluar los primeros estados de curación durante la interacción de Leishmania con las células huésped. Esta técnica se presenta como principal ventaja, permitiendo el estudio de diferentes estados de fagocitosis de Leishmania y la participación de varias proteínas.

Vale la pena señalar que esta técnica también se puede extender a otros tipos de estudios, incluida la infección por bacterias, levaduras o la absorción por otros tipos de células. Las personas que prueben esta técnica deben cuidar el tiempo de exposición de las células a la solución de nucleofector. Además, sugerimos comenzar a probar la transfección utilizando un máximo de dos plásmidos.

Demostrando el procedimiento estará Amanda Reboucas, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para empezar, sembrar 0,2 millones de células THP-1, o macrófagos humanos derivados de monocitos en 500 microlitros RPMI por pocillo en una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono, lavar las células dos veces con solución salina al 0,9% e incubar las células en un medio RPMI completo.

Agregar especies de Leishmania de fase estacionaria a las células en una proporción de 10 parásitos es a una célula huésped, y luego, centrifugar a 720 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de incubar las células a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, lave las células dos veces con solución salina al 0,9% para eliminar cualquier promastigotes no internalizado. Incubar las células en RPMI medio suplementado a 37 grados centígrados durante una hora, y luego, fijar las células con 4% PFA durante 15 minutos.

A continuación, monte los cubreobjetos utilizando los medios de montaje preferidos. Luego, cuente al menos 400 células en campos aleatorios bajo un microscopio de fluorescencia. Para investigar la biogénesis fotovoltaica inducida por Leishmania, comience a transfectar células THP-1 con plásmido sembrando 15 millones de células THP-1 en matraces de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados que contienen 10 mililitros de RPMI Medio completo suplementado con 100 nanogramos por mililitro PMA y 50 micromolares a mercaptoetanol durante 48 horas.

Luego, lave las células una vez en solución salina al 0,9% y separe las células utilizando una solución de disociación celular no enzimática. Luego, centrifugar a 250 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, resuspenda las células THP-1 en un mililitro de RPMI Medium y realice los recuentos en una cámara Neubauer.

Centrifugar las células de nuevo a 250 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Resuspender 2 millones de células en 100 microlitros de solución de Nucleofector e incubar con 0,5 microgramos del recubrimiento plásmido para la proteína de interés, marcada con una proteína fluorescente. Transfiera la suspensión que contiene células THP-1 y ácido nucleico a la cubeta Nucleofector.

Luego, transfecte las células usando el programa Nucleofector Y uno. Recuperar las células transfectadas y la semilla en 500 microlitros de RPMI Medio en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros. Incubar las células y completar RPMI Medio a 37 grados centígrados durante 0,5, 2, 4, 6, 12 y 24 horas.

Deje los cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros a temperatura ambiente y protéjalos de la luz al menos 30 minutos antes de la adquisición. Limpie los cubreobjetos con tejido absorbente. A continuación, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo y luego agregue la diapositiva.

Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toque la corredera. Observe y ajuste el enfoque en el microscopio y elija la opción objetivo 63x con aceite. Abra el programa LIQA y ajuste los láseres en las longitudes de onda 488, 552 y 405.

Seleccione la resolución de imagen como 1024 x 1024. Después de hacer clic en el botón en vivo, configure la pila Z y presione la opción de inicio. Espere la adquisición de la imagen y luego seleccione la opción, proyección máxima, en las herramientas.

Guarde el experimento y exporte las imágenes en formato TIFF a un equipo. Los resultados mostraron que tanto Leishmania Braziliensis LCL, como Leishmania Braziliensis DL, se unen de manera similar a los macrófagos. Además, no se observaron diferencias con respecto a Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL fagocitosis por células huésped.

El reclutamiento de CL3 a la vacuola parasitófora, o PV, inducida por Leishmania Braziliensis LCL o Leishmania Braziliensis DL, se comparó en células infectadas. Después de cuatro horas de infección, se observaron porcentajes similares de PV decorados con LC3 en macrófagos infectados con Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL. Por lo tanto, los resultados mostraron que Leishmania Braziliensis LCL y Leishmania Braziliensis DL interactúan de manera similar con los macrófagos durante la unión, la fagocitosis y la biogénesis de PV con respecto al reclutamiento de LC3.

Las imágenes microscópicas representativas demostraron una transfección eficiente de células THP-1 con plásmidos PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Las personas que prueban este protocolo deben prestar atención a la incubación de temperatura y proteger las muestras de microscopio de la luz, todos los tipos. La modulación de la expresión de las proteínas identificadas que precipitan la fagocitosis de Leishmania demostrará la importancia de esas proteínas en el resultado de la infección por Leishmania.

Podemos extender esta técnica hacia diferentes tipos de estudios de patología y mecanismos asociados con el establecimiento de parásitos y la identificación de dianas para el desarrollo de estrategias terapéuticas.