Biology
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लेजर माइक्रो विकिरण एस चरण के दौरान डीएनए भर्ती का अध्ययन करने के लिए
Chapters
Summary April 16th, 2021
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यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम माइक्रोस्कोपी अध्ययनों के लिए एस-चरण कोशिकाओं की कुशलतापूर्वक पहचान करने के लिए एक गैर-आक्रामक विधि का वर्णन करता है, जैसे लेजर माइक्रो-विकिरण द्वारा डीएनए मरम्मत प्रोटीन भर्ती को मापना।
Transcript
यह प्रोटोकॉल कोशिका चक्र चरण को ध्यान में रखते हुए डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन की स्थानिक और लौकिक भर्ती को समझने में मदद करता है। सेल चक्र भेदभाव के लिए, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन-टैग पीसीएनए का उपयोग एस चरण के मार्कर के रूप में करते हैं, जो अन्य सेल चक्र सिंक्रोनाइजेशन विधियों द्वारा पेश कलाकृतियों को दरकिनार करता है। यह लेजर आधारित माइक्रो-विकिरण के साथ संयुक्त डीएनए क्षति मरम्मत प्रोटीन काइनेटिक्स के लिए अद्वितीय स्थानिक स्थानिक संकल्प देता है।
हमारे प्रोटोकॉल के नियमित उपयोग में सफल कॉन्फोकल इमेजिंग के बुनियादी ज्ञान पर बनाता है। माइक्रो विकिरण से 24 घंटे पहले, चार अच्छी तरह से कक्षित कवर ग्लास पर मीडिया के एक मिलीलीटर को ५०० माइक्रोलीटर में चौथी कोशिकाओं को 10 से कुल आठ प्लेट । माइक्रो-विकिरण से एक घंटे पहले, नियमित विकास माध्यम का आदान-प्रदान इमेजिंग माध्यम के साथ करें जिसमें या तो ओलापरिब या डीएमएसओ जैसे वाहन नियंत्रण शामिल हैं।
इमेजिंग से कम से कम चार घंटे पहले, पर्यावरण कक्ष और माइक्रोस्कोप घटकों को चालू करें। हीटिंग, कार्बन डाइऑक्साइड की आपूर्ति, और आर्द्रता नियामक पर स्विच करें। कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करने से कम से कम एक घंटे पहले लेजर लाइनों के साथ प्रकाश स्रोतों को आरंभ करें।
माइक्रोस्कोप उद्देश्य तेल और माइक्रोस्कोप के नीचे एक कक्ष कवर ग्लास जगह है। एक अतुलकीय आबादी में एस चरण कोशिकाओं का चयन करने के लिए, एस चरण में पीसीएनए टैग किए गए mPlum के अद्वितीय स्थानीयकरण पैटर्न के लिए नेत्र के माध्यम से देखें और देखने के एक क्षेत्र का चयन करें जिसमें माइक्रो-विकिरण के लिए पर्याप्त एस चरण कोशिकाएं हैं। बाइनरी लाइनों को डालने के लिए संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके माइक्रो-विकिरण के लिए ब्याज के क्षेत्र को सेट करें।
लाइनों और रिक्ति की वांछित संख्या निर्धारित करने के लिए, बाइनरी पर क्लिक करें, फिर वांछित संख्या में रेखाओं को आकर्षित करने के लिए इन्सॉल्ड लाइन, सर्कल और एलिप्स का चयन करें, फिर इन बाइनरी लाइनों को आरओआई पर क्लिक करके उत्तेजना आरओआई में परिवर्तित करें, बाइनरी को आरओआई में ले जाएं, फिर किसी भी आरओआई पर सही क्लिक करें और उत्तेजना आरओआई S1 के रूप में उपयोग का चयन करें। इन रेखाओं को देखने के क्षेत्र में रखें ताकि वे कोशिकाओं के नाभिक से गुजरें। माइक्रो-विकिरण से पहले, बाद के विश्लेषण के लिए पीसीएनए फोसी की पहचान करने के लिए, A1 LFOV कॉम्पैक्ट जीयूआई और A1 LFOV स्कैन क्षेत्र खिड़कियों में आवश्यक मापदंडों को स्थापित करके दृश्य के क्षेत्र की एक उच्च संकल्प छवि लें जिसके बाद कैप्चर बटन को मारते हुए। माइक्रो-विकिरण स्थापित करने के लिए, एनडी उत्तेजना टैब खोलें, फिर पूर्व-उत्तेजना छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करने के लिए समय अनुसूची खिड़की का उपयोग करें और फिर गैल्वानो स्कैनर का उपयोग करके पोस्ट-उत्तेजना छवियों की एक श्रृंखला।
समय सारणी विंडो में तीन चरण निर्धारित करें। अधिग्रहण और उत्तेजना कॉलम में, क्रमशः तीन चरणों के लिए अधिग्रहण, उत्तेजना और अधिग्रहण का चयन करें। उत्तेजना चरण के लिए, आरओआई के रूप में S1 सेट करें।
Galvano XY खिड़की में, 405 नैनोमीटर लेजर लाइन के लिए 100% लेजर बिजली उत्पादन सेट और माइक्रो विकिरण के लिए निवास समय निर्धारित किया है। वांछित समय खिड़की और अंतराल के लिए टाइमलैप्स इमेजिंग स्थापित करने के लिए, समय अनुसूची A1 LFOV कॉम्पैक्ट जीयूआई और A1 LFOV स्कैन क्षेत्र खिड़कियों का उपयोग करें। A1 LFOV कॉम्पैक्ट जीयूआई विंडो में इमेजिंग के दौरान फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए लेजर पावर प्रतिशत, लाभ और ऑफसेट सेटिंग्स को अनुकूलित करें।
प्रोटीन की गतिज के आधार पर, समय अनुसूची खिड़की में तीसरे चरण अधिग्रहण पंक्ति के लिए वांछित अंतराल और अवधि निर्धारित करके छवियों या कुल टाइमलैप्स की अवधि के बीच अंतराल का विस्तार या छोटा करें। माइक्रो-विकिरण और बाद में टाइमलैप्स इमेजिंग को निष्पादित करने के लिए अब प्रेस रन करें। टाइमलैप्स इमेजिंग के अंत में, उत्तेजना आरओआई को अलग-अलग छवियों के रूप में बचाएं, जो विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी डाउनस्ट्रीम सॉफ्टवेयर में माइक्रो-विकिरण के निर्देशांक की पहचान करने के लिए उपयोगी होगा।
पीसीएनए में जी 1 और जी-2 चरणों में नाभिक में पूरी तरह से समरूप वितरण होता है। एस चरण में, पीसीएनए डीएनए प्रतिकृति की साइटों के लिए स्थानीयकरण करता है, जिसे नाभिक में उज्ज्वल धब्बे के रूप में कल्पना की जा सकती है। प्रारंभिक एस चरण कोशिकाओं में, धब्बे अपेक्षाकृत छोटे होते हैं और कोशिका के नाभिक में समान रूप से वितरित होते हैं।
मध्य एस चरण में प्रगति करते समय, धब्बे धुंधला हो जाते हैं और नाभिक और नाभिक की परिधि की ओर अधिक स्थानीयकरण करते हैं। देर से एस चरण में, धब्बे संख्या में कम हो जाते हैं, लेकिन तेजी से बड़े हो जाते हैं क्योंकि पीसीएनए देर से प्रतिकृति साइटों पर केंद्रित होता है। ऊर्जा की कम खुराक, जैसे कि 1, 000 माइक्रोसेकंड निवास समय के, ईजीएफपी-FBXL10 की भर्ती को प्रेरित नहीं करते हैं, एक डबल फंसे ब्रेक उत्तरदाता, लेकिन NTHL1-mCherry की भर्ती को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं, एक आधार उत्तेजना मरम्मत मार्ग प्रोटीन जो ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति की साइटों में भर्ती किया जाता है।
3, 000 माइक्रोसेकंड में समय रहता है, दोनों EGFP-FBXL10 और NTHL1-mCherry भर्ती कर रहे हैं, एक लेजर उत्पादन है कि दोनों ऑक्सीडेटिव घावों और डबल फंसे टूट उत्पन्न का प्रदर्शन । EXO1b एक मिनट के आसपास संचय और माइक्रो-विकिरण साइटों के अधिकतम स्तर तक पहुंचता है, और फिर धीरे-धीरे डीएनए घावों से अलग होने लगता है। ओलापरिब की उपस्थिति में, एक मिनट में लेजर धारी पर EXO1b का संचय वाहन नियंत्रण की तुलना में काफी कम है।
यह महत्वपूर्ण है कि माइक्रोस्कोप को गर्म करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाता है और लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए संस्कृति और स्थितियां इष्टतम हैं । इसके अतिरिक्त, विशिष्ट डीएनए घावों के लिए परीक्षण करने के लिए विभिन्न डीएनए क्षति संवाददाताओं के साथ अपनी लेजर सेटिंग्स का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। माइक्रो-विकिरण के बाद, शास्त्रीय जैव रासायनिक विधियों, जैसे अंश, इम्यूनोप्रिपेशन, या सीआईपी के साथ परिणामों को मान्य करने पर विचार करें।
ये एक बड़ी सेल आबादी का नमूना लेते हैं, इस प्रकार सांख्यिकीय शक्ति प्रदान करते हैं।
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