激光微辐射研究S阶段DNA招募

本协议有助于了解DNA损伤修复蛋白的空间和时间招募，同时考虑细胞周期阶段。对于细胞周期歧视，我们使用荧光蛋白标记的 PCNA 作为 S 相的标志，从而规避其他细胞周期同步方法引入的人工制品。这与基于激光的微辐照相结合，为DNA损伤修复蛋白质动力学提供了无与伦比的空间分辨率。

成功常规使用我们的协议建立在共聚焦成像的基本知识的基础上。在微辐射前24小时，在500微升的4个井室盖玻璃上，将总共8到10个细胞镀在1毫升的介质上。在微辐照前一小时，将常规生长介质与含有奥拉帕里布或 DMSO 等车辆控制的成像介质交换。

在成像前至少四小时，打开环境室和显微镜组件。打开暖气、二氧化碳供应和湿度调节器。在将细胞转移到显微镜之前，至少一小时先将光源与激光线一起初始化。

将显微镜涂油，并在显微镜下放置一个室盖玻璃。要选择异步种群中的 S 相细胞，请通过眼部查看 S 相标记 PCNA 的 mPlum 标记 PCNA 的独特定位模式，并选择具有足够 S 相细胞进行微辐照的视场。使用相关软件插入二进制线，设置微辐照感兴趣的区域。

要设置所需的行数和间距，单击二进制，然后选择插入行、圆和椭圆以绘制所需的行数，然后通过单击投资回报率将这些二进制行转换为刺激投资回报率，将二进制线移动到投资回报率，然后右键单击任何 ROI，并选择用作刺激性投资回报率 S1。将这些线放在视野中，以便它们通过细胞核。在微辐照之前，要识别 PCNA foci 以供以后分析，请在 A1 LFOV 紧凑型 GUI 和 A1 LFOV 扫描区域窗口中设置必要的参数，然后按下捕获按钮，从而拍摄更高的视野分辨率图像。要设置微辐照，请打开 ND 刺激选项卡，然后访问时间安排窗口，获取一系列刺激前图像，然后使用 Galvano 扫描仪获取一系列刺激后图像。

在时间安排窗口中设置三个阶段。在采集和刺激列中，分别选择收购、刺激和收购三个阶段。对于刺激阶段，将 S1 设置为投资回报率。

在Galvano XY窗口，为405纳米激光线设置100%的激光功率输出，并设置微辐照的停留时间。要为所需的时间窗口和间隔设置时间拉时成像，请使用时间表 A1 LFOV 紧凑型 GUI 和 A1 LFOV 扫描区域窗口。优化激光功率百分比、增益和偏移设置，以减少 A1 LFOV 紧凑型 GUI 窗口成像过程中的照片漂白。

根据蛋白质的动能，通过在时间安排窗口中设置第三阶段采集行所需的间隔和持续时间，延长或缩短图像之间的间隔或总延时持续时间。现在按运行以执行微辐照和随后的超时成像。在延时成像结束时，将刺激性 ROI 保存为单独的图像，这将有助于识别用于分析的任何下游软件中的微辐照坐标。

PCNA 在 G1 和 G2 阶段的核中具有完全均匀的分布。在 S 阶段，PCNA 定位到 DNA 复制点，可可视化为细胞核中的亮点。在早期S相细胞中，斑点相对较小，并且在整个细胞核中分布均匀。

在进入中 S 阶段时，斑点变得模糊，并更多地向核和核的周界定位。在后期 S 阶段，点数量减少，但随着 PCNA 集中在后期复制站点，斑点变得越来越大。低剂量的能量，如1000微秒的居住时间，不诱导招募EGFP-FBXL10，双搁浅断裂反应器，但足以诱导招募NTHL1-mCherry，一种基础切除修复途径蛋白，被招募到氧化DNA损伤部位。

在3000微秒的停留时间，EGFP-FBXL10和NTHL1-mCherry都被招募，展示了产生氧化病变和双链断裂的激光输出。EXO1b 在一分钟左右达到最大积累水平和微辐射位点，然后慢慢开始脱离 DNA 病变。在奥拉帕里布的存在下，与车辆控制相比，在一分钟内激光条纹上积累 EXO1b 的积累要少得多。

至关重要的是，显微镜有充足的时间加热，并且文化和条件是每个实验的最佳选择，以确保一致的结果。此外，重要的是要优化你的激光设置与不同的DNA损伤记者，以测试特定的DNA病变。微辐射后，考虑使用经典生化方法（如分馏、免疫沉淀或 ChIP）验证结果。

这些方法对较大的细胞群进行采样，从而提供统计强度。