अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिका संस्कृति के लिए एक क्रिस्टलीय नैनोसेल्यूलोज एम्बेडेड Agarose Biomaterial स्याही का निर्माण

यह प्रोटोकॉल जटिल 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रयोगों से पहले संवेदनशील प्राथमिक और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ संभावित साइटोटॉक्सिक प्रभावों के लिए उम्मीदवार बायोमटेरियल स्याही को स्क्रीन करने के लिए एक आसान और तेजी से दृष्टिकोण प्रदान करता है। बायोमटेरियल स्याही निर्माणों पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को डाउनस्ट्रीम साइटोटॉक्सिसिटी या बायोमार्कर विश्लेषण करने के लिए कोमल धोने से निर्माणों से आसानी से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग के लिए सीधे प्रासंगिक है जिसमें बायोप्रिंटेड ऊतक जो प्रत्यारोपण के लिए नियत हैं, उन्हें प्राथमिक कोशिकाओं और बायोकंपैटिबल बायोमटेरियल स्याही से बनाया जाना चाहिए।

शुरू करने के लिए, INKREDIBLE + 3 D बायोप्रिंटर पर स्थापना के लिए एक जैव स्याही कारतूस तैयार करें। सबसे पहले, तीन मिलीलीटर बायोमैटेरियल स्याही कारतूस से नीले अंत कैप्स को हटा दें और बायो स्याही कारतूस के लुएर लॉक एंड के लिए एक बाँझ 22 गेज शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल चिपकाएं। कारतूस के विपरीत छोर के लिए printhead एक या PH1 के लिए हवा दबाव की आपूर्ति टयूबिंग कनेक्ट करें और PH1 के ऊर्ध्वाधर स्लॉट में अपने संलग्न शंक्वाकार bioprinting नोजल के साथ कारतूस डालें।

अगला, दृढ़ता से एक शंक्वाकार bioprinting नोजल प्रिंटहेड के नीचे विस्तार के साथ PH1 में कारतूस सीट. PH1 दक्षिणावर्त पर पेंच कस जब तक उंगली तंग जगह में जैव स्याही कारतूस ताला करने के लिए. ध्यान दें कि 3 डी bioprinting PH2 खाली छोड़ दिया के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है।

बायोप्रिंटर पर पावर और एक यूएसबी 2.0 केबल के माध्यम से 3 डी बायोप्रिंटर से जुड़े पीसी पर बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। सॉफ़्टवेयर में, इसे 3 डी बायोप्रिंटर के साथ सिंक करने के लिए कनेक्ट बटन पर क्लिक करें। 3 डी बायोप्रिंटर के मुख्य नियंत्रण मेनू में तीन विकल्पों का निरीक्षण करें।

सबसे पहले, बायोप्रिंट तैयार करें। दूसरा, उपयोगिताओं मेनू. और तीसरा, स्टेटस स्क्रीन।

तैयार bioprint विकल्प का चयन करें, फिर करने के लिए नीचे स्क्रॉल करें और घर अक्षों विकल्प का चयन करें। XYZ अक्षों के सफल अंशांकन के बाद, प्रिंट बिस्तर की ऊंचाई थोड़ी कम हो जाएगी और प्रिंट हेड प्रिंट बेड के केंद्र बिंदु के ऊपर स्थानांतरित हो जाएंगे। 24-अच्छी तरह से प्लेटों में बायोप्रिंटिंग के लिए शुरुआती बिंदु अंशांकन के साथ आगे बढ़ने के लिए, अपने सील किए गए प्लास्टिक रैपिंग से एक बाँझ 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट को हटा दें और एक स्थायी मार्कर के साथ प्लेट के नीचे अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र बिंदु पर एक बिंदु को चिह्नित करें।

प्लेट कवर निकालें और प्रिंट बिस्तर के सामने बाएं कोने में स्थित अच्छी तरह से डी 1 के साथ प्रिंट बिस्तर पर 24-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट रखें। मुख्य नियंत्रण मेनू पर, उपयोगिताएँ मेनू का चयन करें और तब अक्ष ले जाएँ. एक्स और वाई अक्षों के साथ एक मिलीमीटर वृद्धि में प्रिंट हेड्स को तब तक ले जाएं जब तक कि PH1 का शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल सीधे अच्छी तरह से D1 के तहत चिह्नित डॉट पर न हो। यदि आवश्यक हो, तो 0.1 मिलीमीटर वृद्धि में प्रिंट हेड्स को स्थानांतरित करके डॉट पर शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल की स्थिति को ठीक करें।

शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल के एक्स और वाई निर्देशांक रिकॉर्ड करें जब सीधे अच्छी तरह से डी 1 के केंद्र पर जैसा कि 3 डी बायोप्रिंटर के नियंत्रण कक्ष स्क्रीन में इंगित किया गया है और निर्देशांक को चिह्नित करता है। इसके बाद, प्रिंट बेड को एक मिलीमीटर वृद्धि में उठाएं जब तक कि अच्छी तरह से डी 1 का तल लगभग प्रिंटहेड एक में स्थापित शंक्वाकार बायोप्रिंटिंग नोजल को छू रहा हो। यदि आवश्यक हो तो 0.1 मिलीमीटर वृद्धि में प्रिंट बिस्तर के आंदोलन को ठीक करें।

उपयोगिताओं मेनू से, Z अक्ष अंशांकन विकल्प का चयन करें और आगे का चयन करें और स्टोर Z अंशांकन विकल्प की पुष्टि करें। मुख्य मेनू पर लौटें और तैयार बायोप्रिंट विकल्प का चयन करें। नीचे स्क्रॉल करें और कैलिब्रेट जेड विकल्प का चयन करें।

सही प्रारंभिक बिंदु निर्देशांक के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट ज्यामितीय कोड या जी-कोड अपडेट करें। बायोप्रिंट सॉफ़्टवेयर पर प्रदान की गई 24-अच्छी तरह से जी-कोड फ़ाइल खोलें। पिछले चरणों में प्राप्त मानों के साथ पंक्ति एक पर X और Y निर्देशांक अद्यतन करें और फ़ाइल को किसी नए नाम के अंतर्गत सहेजें.

सुनिश्चित करें कि वायवीय पंप कसकर INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर के रियर एयर इनटेक पोर्ट से जुड़ा हुआ है और इसे चालू करें। INKREDIBLE + 3 डी बायोप्रिंटर के दाईं ओर स्थित आगे के नियंत्रण घुंडी को बाहर निकालें। सुनिश्चित करें कि बायोप्रिंटर के सामने स्थित PH1 और PH2 के लिए डिजिटल दबाव गेज प्रत्येक शून्य किलोपास्कल के करीब पढ़ें।

धीरे-धीरे आगे के नियंत्रण घुंडी को दक्षिणावर्त घुमाएं जब तक कि PH1 के लिए बाएं गेज पर इंगित दबाव 12 किलोग्राम तक नहीं पहुंच जाता। स्थापित कारतूस के प्रिंट नोजल के नीचे एक मुड़ा हुआ टिशू पेपर या वाटरप्रूफ सीलिंग फिल्म का एक टुकड़ा रखें, प्रिंट नोजल को छूने के लिए सावधान न रहें। 3 डी बायोप्रिंटर पर मुख्य नियंत्रण मेनू से, बायोप्रिंट तैयार करें का चयन करें।

पर नेविगेट करें और PH1 चालू करें का चयन करें। ध्यान दें कि जैव स्याही प्रिंट नलिका से बाहर निकालना शुरू कर देता है। यदि आवश्यक हो, तो नियंत्रण घुंडी दक्षिणावर्त घूर्णन करके बाहर निकालना दबाव में वृद्धि जब तक जैव स्याही एक निरंतर फिलामेंट में extruded है और नए दबाव सेटिंग रिकॉर्ड है.

जैव स्याही के बाहर निकालना बंद करने के लिए PH1 बंद करें का चयन करें। प्रिंट बेड से बाहर निकाले गए बायो इंक वाले टिशू पेपर या फिल्म को हटा दें और बायोप्रिंटर दरवाजा बंद कर दें। एक 24-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में rectilinear hydrogel substrates के 3 डी bioprinting प्रदर्शन करने के लिए, मुख्य नियंत्रण मेनू से उपयोगिताओं मेनू का चयन करें, फिर अक्षम एसडी प्रिंट का चयन करें जो बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर को मुद्रण के लिए 3 डी बायोप्रिंटर को जी-कोड फ़ाइलों को प्रसारित करने की अनुमति देगा।

बायोप्रिंटर सॉफ़्टवेयर में लोड बटन पर क्लिक करें और अपडेट किए गए 24-वेल प्लेट जी-कोड फ़ाइल का चयन करें। सॉफ़्टवेयर में दाएं हाथ के नियंत्रण कक्ष में, प्रिंट पूर्वावलोकन टैब का चयन करें और अच्छी तरह से डी 1 में बायोप्रिंटिंग शुरू करने के लिए प्रिंट बटन पर क्लिक करें। रेक्टिलिनियर निर्माणों के बायोप्रिंटिंग के पूरा होने पर, अपने ढक्कन के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें और इसे कक्षा II जैव सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं। बाँझ 50 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान की दो बूंदों में प्रत्येक रेक्टिलिनियर निर्माण को विसर्जित करें और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।

प्रत्येक अच्छी तरह से निर्माण से कैल्शियम क्लोराइड समाधान को ध्यान से एस्पिरेट करें और अतिरिक्त कैल्शियम क्लोराइड को हटाने के लिए 1X PBS के एक मिलीलीटर में एक बार कुल्ला करें। बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल निर्माणों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए, ताजा 1X पीबीएस में 3 डी बायोप्रिंटेड रेक्टिलिनियर निर्माणों को बनाए रखें जब तक कि अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मस्तूल कोशिकाएं निर्माणों पर बीज देने के लिए तैयार न हों। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए बीएमएमसी के आगे और साइड स्कैटर पैरामीटर के आधार पर, यह देखा गया कि उच्चतम सीएनसी एकाग्रता के साथ हाइड्रोजेल सब्सट्रेट ने सीएनसी एगारोज़ डी-मैनिटोल हाइड्रोजेल सब्सट्रेट की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत बीएमएमसी की तुलना में बीएमएमसी के मूल आकार या ग्रैन्युलैरिटी को नहीं बदला।

प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए बीएमएमसी की पारगम्यता के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि परीक्षण किए गए सीएनसी सांद्रता में से कोई भी बीएमएमसी व्यवहार्यता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालता है। सीएनसी एगारोज़ सब्सट्रेट ने सीएनसी सांद्रता में मस्तूल सेल बायोमाकर्स की अभिव्यक्ति को 2.5% से अधिक या बराबर बढ़ा दिया हालांकि, इन रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का स्तर 2.5% और 12.5% सीएनसी के बीच अपेक्षाकृत सुसंगत रहा जो एक प्रभाव का सुझाव देता है जो सीएनसी की एकाग्रता से स्वतंत्र है। XTT परख ने प्रदर्शित किया कि 3 डी बायोप्रिंटेड हाइड्रोजेल मचानों पर सुसंस्कृत बीएमएमसी की चयापचय गतिविधि सभी परीक्षण किए गए समय बिंदुओं में लगभग 100% पर अपेक्षाकृत सुसंगत रही।

इसी तरह, LDH रिलीज और PI डाई बहिष्करण assays BMMCs की व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ। मुद्रण नोजल गेज के चयन, 3D बायोप्रिंटर के अक्षों के अंशांकन, और एक्सट्रूज़न दबाव सेटिंग उच्च गुणवत्ता वाले 3 D निर्माणों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मुद्रण सुनिश्चित करेगा। जिस आसानी से मस्तूल कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है, उन्हें अपने सेलुलर कार्यों के किसी भी पहलू का आगे अध्ययन करने के लिए जैविक assays की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा जांच करने की अनुमति देता है।