Fabrikasjon av en krystallinsk nanocellulose innebygd agarose biomateriale blekk for benmarg-avledet mastcellekultur

Denne protokollen gir en enkel og rask tilnærming til skjermkandidat biomateriale blekk for potensielle cytotoksiske effekter mot sensitive primære og immunceller før komplekse 3D bioprinting eksperimenter. Etter inkubasjon av immuncellene på biomaterialets blekkkonstruksjoner, kan cellene enkelt hentes fra konstruksjonene ved skånsom vask for å utføre nedstrøms cytotoksisitet eller biomarkøranalyser. Denne protokollen er direkte relevant for vevsteknikk der biotrykked vev som er bestemt for transplantasjon, må konstrueres fra primærceller og biokompatible biomaterialeblekk.

Til å begynne med, klargjør en bioblekkpatron for installasjon på INKREDIBLE +3D bioprinter. Først fjerner du de blå endehettene fra den tre milliliter biomaterialeblekkpatronen og fester en steril 22 gauge konisk bioprintdyse til Luer lock enden av bioblekkpatronen. Koble lufttrykkstilførselsslangen for skrivehodet en eller PH1 til motsatt ende av patronen og sett patronen med den vedlagte koniske bioprintdysen inn i det vertikale sporet til PH1.

Deretter setter du patronen godt i PH1 med en konisk bioprintdyse som strekker seg under skrivehodet. Stram skruen på PH1 med klokken til fingeren er stram for å låse bioblekkpatronen på plass. Vær oppmerksom på at 3D-bioprintingen kan utføres med PH2 stå tom.

Slå på bioprinteren og start bioprinterprogramvaren på en PC som er koblet til 3D-bioprinteren via en USB 2.0-kabel. I programvaren klikker du på tilkoblingsknappen for å synkronisere den med 3D-bioprinteren. Vær oppmerksom på tre alternativer i hovedkontrollmenyen til 3D-bioprinteren.

Først forbereder du bioprint. For det andre, verktøymeny. Og for det tredje, statusskjerm.

Velg alternativet for klargjøring av biotrykk, rull deretter ned til og velg alternativet for hjemmeakser. Etter vellykket kalibrering av XYZ-aksene, vil høyden på utskriftssengen senkes litt og skrivehodene flyttes til over midten av utskriftssengen. For å fortsette med startpunktkalibrering for bioprinting i 24-brønnsplater, fjern en steril 24-brønns kulturplate fra den forseglede plastinnpakningen og merk en prikk på midtpunktet på brønn D1 på undersiden av platen med en permanent markør.

Fjern platedekselet og plasser den 24-brønns kulturplaten på utskriftssengen med brønn D1 plassert foran til venstre på utskriftssengen. Velg verktøymeny på hovedkontrollmenyen, og flytt deretter aksen. Flytt skrivehodene i en millimeter trinn langs X- og Y-aksene til den koniske bioprintdysen til PH1 er rett over prikken merket under brønn D1. Om nødvendig finjusterer du posisjonen til den koniske bioprintdysen over prikken ved å flytte skrivehodene i trinn på 0,1 millimeter.

Registrer X- og Y-koordinatene til den koniske bioprintdysen når direkte over midten av brønn D1 som angitt i kontrollpanelskjermen på 3D-bioprinteren og merk ned koordinatene. Deretter hever du utskriftssengen i en millimeter trinn til bunnen av brønn D1 nesten berører den koniske bioprintdysen som er installert i skrivehodet. Finjuster bevegelsen av utskriftssengen i trinn på 0,1 millimeter om nødvendig.

Velg Z-aksekalibreringsalternativet på verktøymenyen, og velg og bekreft videre alternativet for butikk Z-kalibrering. Gå tilbake til hovedmenyen og velg prepare bioprint alternativet. Rull ned til og velg kalibrer Z-alternativet.

Oppdater den geometriske koden eller G-koden med riktig startpunktkoordinater. Åpne den medfølgende 24-brønns G-kodefilen på bioprintprogramvaren. Oppdater X- og Y-koordinatene på linje én med verdiene som er oppnådd i tidligere trinn, og lagre filen med et nytt navn.

Kontroller at den pneumatiske pumpen er tett koblet til den bakre luftinntaksporten til INKREDIBLE+3D bioprinteren og slå den på. Trekk ut den fremre kontrollknappen på høyre side av INKREDIBLE+3D bioprinter. Sørg for at de digitale trykkmålerne for PH1 og PH2 som er plassert på forsiden av bioprinteren hver leser nær null kilopascal.

Drei den fremre kontrollknappen langsomt med klokken til trykket som er angitt på venstre måler for PH1, når 12 kilopascals. Legg et brettet silkepapir eller et stykke vanntett tetningsfilm under trykkdysen på den installerte patronen, og pass på at du ikke berører skriverdysen. Fra hovedkontrollmenyen på 3D-bioprinteren velger du lag bioprint.

Naviger til og velg slå på PH1. Vær oppmerksom på at bioblekkfargen begynner å ekstrudere fra skriverdysen. Hvis det er nødvendig, øker du ekstruderingstrykket ved å dreie kontrollknappen med klokken til bioblekkfargen ekstruderes i en kontinuerlig filament og registrerer den nye trykkinnstillingen.

Velg Slå av PH1 for å stoppe ekstrudering av bioblekk. Fjern silkepapir eller film som inneholder ekstrudert bioblekk fra utskriftssengen og lukk bioprinterdøren. For å utføre 3D bioprinting av rettlinjede hydrogelsubstrater i et 24-brønns plateformat, velg verktøymenyen fra hovedkontrollmenyen, og velg deretter deaktiver SD-utskrift som lar bioprinterprogramvaren overføre G-kodefiler til 3D-bioprinteren for utskrift.

Klikk på lastknappen i bioprinterprogramvaren og velg den oppdaterte G-kodefilen med 24 brønnplater. I høyre kontrollpanel i programvaren velger du forhåndsvisningsfanen og klikker på utskriftsknappen for å starte bioprinting i brønn D1. Etter ferdigstillelse av bioprinting av de rettlinjede konstruksjonene, dekk 24-brønnsplaten med lokket og flytt den til et klasse II biosikkerhetsskap. Senk hver rettlinjet konstruksjon i to dråper steril 50 millimolar kalsiumkloridoppløsning og inkuber ved romtemperatur i fem minutter.

Aspirer forsiktig kalsiumkloridoppløsningen fra hver brønnkonstruksjon og skyll en gang i en milliliter 1X PBS for å fjerne overflødig kalsiumklorid. For å forhindre dehydrering av de biotrykte hydrogelkonstruksjonene, opprettholde 3D bioprinted rectilinear konstruksjoner i frisk 1X PBS til benmargsavledede mastceller er klare til å bli sådd på konstruksjonene. Basert på fremre og sidespredningsparametere til BMMCene analysert av strømningscytometri, ble det observert at hydrogelsubstratet med den høyeste CNC-konsentrasjonen ikke endret den opprinnelige størrelsen eller granulariteten til BMMCene sammenlignet med BMMCene som ble dyrket i fravær av CNC-agarose D-mannitol hydrogel substrater.

Strømningscytometrisk analyse av BMMCs permeabilitet til propidiumjodid viste at ingen av CNC-konsentrasjonene som ble testet, fremkalte noen negativ effekt på BMMC-levedyktigheten. CNC-agarose-substratet økte uttrykket av mastcellebiomarkørene ved CNC-konsentrasjoner større enn eller lik 2,5%Imidlertid forble uttrykksnivåene til disse reseptorene relativt konsistente mellom 2,5% og 12,5% CNC som antyder en effekt som er uavhengig av konsentrasjonen av CNC. XTT-analysen viste at den metabolske aktiviteten til BMMCene som ble dyrket på 3D bioprinted hydrogel stillaser forble relativt konsistent på ca 100% på tvers av alle testede tidspunkter.

På samme måte viste LDH-utgivelsen og PI-fargeeksklusjonsanalysene ingen signifikante endringer i levedyktigheten til BMMCene. Nøye oppmerksomhet på valg av trykkdysemåler, kalibrering av 3D-bioprinterens akser og ekstruderingstrykkinnstillingen vil sikre reproduserbar utskrift av høykvalitets 3D-konstruksjoner. Den enkle som mastcellene kan hentes med, gjør at de kan undersøkes av et bredt spekter av biologiske analyser for å studere alle aspekter av deres cellulære funksjoner ytterligere.